Test komórkowy oparty na impedancji do pomiaru wielości infekcji wirusem grypy

Streszczenie

Źródło: Labadie, T., et al., Monitorowanie przeżywalności wirusa grypy poza gospodarzem za pomocą analizy komórek w czasie rzeczywistym. J. Vis. Exp. (2021)

W tym filmie omawiamy korelację między CIT₅₀ a mnogością infekcji wirusowych. Komórki zakażone wirusem wykazują działanie cytopatyczne, powodując ich śmierć i oderwanie od złotej mikroelektrody, co z kolei zmniejsza impedancję.

Protokół

1. Korelacja między wartościami CIT₅₀ a mnogością infekcji

1. Dodać 100 μl sterylnej pożywki hodowlanej 1x MEM do każdego dołka E-płytki. Włóż płytkę E do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35°C.
2. Zmierz tło zgodnie z opisem:
3. Otwórz oprogramowanie.
   1. W polu "Domyślna konfiguracja wzorca eksperymentu" wybierz wybraną podstawkę (podstawki) i kliknij dwukrotnie górną stronę, a następnie wprowadź nazwę eksperymentu. Kliknij "Układ" i wprowadź niezbędne informacje o próbce dla każdego wybranego dołka płyty; następnie kliknij "Zastosuj" po zakończeniu. Kliknij "Zaplanuj" | "Kroki" | "Dodaj krok". Oprogramowanie automatycznie dodaje krok 1 s w celu zmierzenia impedancji tła (CI).
   2. Kliknij "Start/Kontynuuj" w zakładce "Wykonaj". Kliknij "Wykres", dodaj wszystkie próbki, wybierając odpowiednie dołki i upewnij się, że CI wynosi od -0,1 do 0,1 przed przejściem do następnego kroku.
4. Wyjmij płytkę E z podstawki.
5. Wysiewać 3 x^10,4 świeżo rozszczepionych komórek MDCK w każdym dołku elektronicznej płytki mikromiareczkowej i hodować je przez 24 godziny w temperaturze 35°C z 5% CO_{2 ,} tak aby znajdowały się w fazie replikacji podczas infekcji IAV.
6. Zainfekuj komórki MDCK różnymi 10-krotnymi rozcieńczeniami znanego miana wirusa H1N1 6log₁₀TCID₅₀/ml wirusa H1N1, używając odwrotnego pipetowania w celu odtworzenia, wykonując poniższe czynności:
   1. Przepłukać komórki MDCK 2x 100 μL MEM bez FCS (pożywki do namnażania wirusa). Należy pamiętać o usunięciu wszystkich pożywek po drugim myciu, aby uniknąć dalszego rozcieńczania inokulum.
   2. Dodać 100 μl zawiesiny wirusa do każdej studzienki za pomocą pipety jednokanałowej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, zacznij od lewej do prawej, a następnie od góry do dołu w talerzu, przykrywając pozostałe studzienki pokrywką.
   3. Włóż płytkę do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35°C. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć gwałtownych ruchów prowadzących do zanieczyszczenia.
   4. Rozpocznij monitorowanie impedancji ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin zgodnie z opisem:
      1. Włóż płytkę E do kieszeni kołyski. Kliknij "Zaplanuj" | "Dodaj krok" w oprogramowaniu i wprowadź wartości, aby monitorować komórki co 30 minut przez 200 powtórzeń. Następnie wybierz "Start/Kontynuuj".
   5. Po dwóch cyklach pomiarów (tj. 30 minut) zatrzymaj aparat klikając na "Pauza" w zakładce "Wykonaj" i wyjmij E-tabliczkę z kołyski.
   6. Dodaj 1 μg/ml trypsyny TPCK do pożywki do rozmnażania wirusa, aby rozszczepić hemaglutyninę wirusa.
   7. Dodać 100 μl pożywki do rozmnażania wirusów zawierającej trypsynę TPCK do każdej studzienki i włożyć płytkę E do kieszeni kołyski.
   8. Kliknij "Start/Kontynuuj" w zakładce "Wykonaj".
      nuta: Nie zapomnij stworzyć kontroli negatywnej odpowiadającej fałszywie zainfekowanym komórkom poprzez zastąpienie zawiesiny wirusa pożywką do namnażania wirusa.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
E-Plate 16 (6 płyt)	ACEA Biosciences, Inc	5469830001	E-tabliczki są dostępne w różnych opakowaniach
MEM 1X	Technologie życiowe (gibco)	31095029
TPCK-Trypsyna	Worthington	LS003740
xCELLigence Przyrząd do analizy komórek w czasie rzeczywistym S16	ACEA Biosciences, Inc	380601310	Aparaty xCELLigence RTCA S16 są dostępne w różnych formatach (16-dołkowe, 96-dołkowe, jedno lub wielopłytkowe)