1. Przygotowanie odczynników i materiałów wyjściowych
- Przygotowanie komórek MDCK i sterylnej pożywki do hodowli komórkowych
- Hoduj komórki Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) w zmodyfikowanej pożywce Eagle's Medium (MEM) uzupełnionej 10% inaktywowaną termicznie surowicą cielęcą płodu (FCS) i antybiotykami (100 jednostek/ml penicyliny, 100 mg/ml streptomycyny).
- Po rozmrożeniu należy pasować komórki MDCK co najmniej 2 razy przed ich zakażeniem, aby zapewnić całkowite wyzdrowienie (ale mniej niż 30 pasaży, aby uniknąć dryfu w fenotypach komórek).
- Wysiew 75 cm2 kolby do hodowli tkankowych zawierające 30 ml sterylnego 1x MEM z 7,5 x 106 komórek MDCK i inkubować w temperaturze 37 °C w wilgotnym inkubatorze 5% CO2 .
- Przygotowanie sprzętu do monitorowania impedancji
- Umieścić instrument w inkubatorze w temperaturze 35 °C i pozostawić do rozgrzania przez co najmniej 2 godziny.
- Podłącz go do jednostki sterującej umieszczonej na zewnątrz inkubatora.
- Postępuj zgodnie z procedurami czyszczenia zgodnie z zaleceniami producenta przed rozpoczęciem pozostałej części eksperymentu.
- Produkcja zapasów IAV na komórkach MDCK
- Aby namnażać i amplifikować wirusy H1N1, należy wysiać 7,5 x 106 komórek MDCK na dwóch kolbach do hodowli tkankowych o długości 75cm2 i inkubować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C, aby osiągnąć 90%–100% konfluencji.
- Zdekantować pożywkę do hodowli komórkowych z monowarstwy komórek w kolbach o długości 75 cm2. Umyj komórki 5 ml sterylnego 1x PBS.
- Usuń PBS i dodaj 5 ml 1x PBS, aby ponownie umyć komórki.
- Oznaczyć jedną kolbę jako kontrolę i usunąć PBS przed dodaniem 15 ml pożywki do namnażania wirusa (1x MEM z 0% FCS) ostrożnie na monowarstwę. Inkubować tę kolbę w inkubatorze utrzymywanym w temperaturze 35 °C z 5% CO2 . Użyj go do porównania po 3 dniach rozmnażania.
- Rozmrozić jedną fiolkę z zapasem IAV w temperaturze pokojowej. Rozcieńczyć wirusa do odpowiedniego stężenia w probówce o pojemności 1,5 ml zawierającej pożywkę do namnażania wirusa (1x MEM z 0% FCS).
- Usunąć 1x PBS z kolby o długości 75cm2 i zainfekować komórki MDCK przy wielokrotności infekcji (MOI) 1 x 10-3 lub 1 x 10-4 jednostek tworzących blaszkę na komórkę (pfu / komórkę) poprzez dodanie 1 ml rozcieńczonego wirusa do monowarstwy komórki.
- Adsorbować wirusa do komórek MDCK przez 45 minut w temperaturze pokojowej, mieszając kolbę regularnie co 15 minut.
- Delikatnie usunąć inokulum i dodać 15 ml pożywki do namnażania wirusa na kolbę zawierającą 1 μg/ml trypsyny TPCK (trypsyna / L-1-tosylamid-2-fenyloetylochlorometyloketon), aby rozszczepić wirusową hemaglutyninę HA0 na podjednostki HA1 i HA2 (zdarzenie wymagane do fuzji HA z błoną endosomalną i uwolnienia genomu wirusa).
- Inkubować kolby w temperaturze 35 °C i 5% CO2 przez co najmniej 3 dni w celu replikacji wirusa.
- Obserwuj komórki MDCK pod mikroskopem przy 40-krotnym powiększeniu i poszukaj efektów cytopatycznych (CPE) na komórkach (porównując je z kolbą kontrolną komórki). Jeśli CPE nie jest kompletny (tj. około 80% komórek jest odłączonych od substratu), należy umieścić kolby z powrotem w inkubatorze na dodatkowe 24 godziny.
- Po zakończeniu CPE zdekantować supernatant do hodowli komórkowych i odwirować przy 300 x g przez 10 minut, aby osadzać resztki komórkowe.
- Przenieść oczyszczony supernatant do probówki o pojemności 15 ml, a podwielokrotne wirusy potomne do sterylnych fiolek kriogenicznych jednorazowego użytku. Natychmiast umieść krioprobówki w temperaturze -80 °C, aby zamrozić i przechowywać wirusy.
- Zainfekuj komórki MDCK różnymi 10-krotnymi rozcieńczeniami znanego miana wirusa H1N1 o nazwie 6 log10 TCID50/ml, stosując odwrotne pipetowanie w celu odtworzenia, wykonując poniższe czynności:
- Przepłukać komórki MDCK 2x 100 μL MEM bez FCS (pożywki do namnażania wirusa). Należy pamiętać o usunięciu wszystkich pożywek po drugim myciu, aby uniknąć dalszego rozcieńczania inokulum.
- Dodać 100 μl zawiesiny wirusa do każdej studzienki za pomocą pipety jednokanałowej. Aby uniknąć zanieczyszczenia, zacznij od lewej do prawej, a następnie od góry do dołu na płycie, przykrywając pozostałe studzienki pokrywką.
- Włóż płytkę do kieszeni kołyski instrumentu w temperaturze 35 °C. Zachowaj ostrożność, aby uniknąć gwałtownych ruchów prowadzących do zanieczyszczenia.
- Rozpocznij monitorowanie impedancji ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin, jak opisano w kroku 2.10.
- Po dwóch cyklach pomiarów (tj. 30 minut) zatrzymaj aparat klikając na "Pauza" w zakładce "Wykonaj" i wyjmij E-tabliczkę z kołyski.
- Dodać 1 μg/ml trypsyny TPCK do pożywki do rozmnażania wirusa, aby rozszczepić hemaglutyninę wirusa.
- Dodać 100 μl pożywki do rozmnażania wirusów zawierającej trypsynę TPCK do każdej studzienki i włożyć płytkę E do kieszeni kołyski. 8. Kliknij "Start/Kontynuuj" w zakładce "Wykonaj".
nuta: Nie zapomnij stworzyć kontroli negatywnej odpowiadającej fałszywie zainfekowanym komórkom poprzez zastąpienie zawiesiny wirusa pożywką do namnażania wirusa.
2. Kinetyka przetrwania IAV
- Wystawić IAV na działanie soli destylowanej w temperaturze 35 °C i przetestować ich zakaźność w czasie, mierząc spadek impedancji komórek.
- Przygotować solankową wodę destylowaną, dodając NaCl do końcowego stężenia 35 g/l w wodzie destylowanej. Dodaj 900 μl soli fizjologicznej do 2 ml krioprobówek.
- Dodaj 100 μl wywaru wirusowego do soli fizjologicznej i umieść krioprobówki w inkubatorze (35 °C, 5% CO2) na 1 godzinę, 24 godziny lub 48 godzin.
- Wysiewać 100 μl (zawierających 3 x 104) świeżo rozszczepionych komórek MDCK na 16-dołkowej płytce do mikromiareczkowania i hodować przez 24 godziny w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Zakażone komórki 100 μl wystawionych wirusów (uprzednio rozcieńczonych 10-krotnie w pożywce hodowlanej) przy użyciu metody odwróconego pipetowania w celu powtórzenia przez powtórzenie ppkt 1.4.
- Monitoruj impedancję ogniwa co 15 minut przez co najmniej 100 godzin.
