Test substancji reagujących z kwasem tiobarbiturowym w celu oceny stresu oksydacyjnego w surowicy ludzkiej

Streszczenie

Źródło: Borges, C. R. et al., Ocena stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych przy użyciu testu substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego. J. Vis. Exp. (2020)

Ten film demonstruje test substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) do oceny stresu oksydacyjnego w próbkach biologicznych.

Protokół

Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.

1. Test TBARS

UWAGA: Gdy test TBARS zostanie rozpoczęty, powinien zostać zakończony bez zatrzymywania.

1. Pobrać tyle próbek i wzorców, które są odwirowywane w temperaturze 1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu należy przechowywać szklane probówki zawierające próbki i wzorce w szklanych probówkach RT. w zależności od potrzeb w odniesieniu do liczby próbek do analizy i oznaczyć je nazwami próbek. Następnie dodaj 100 μl każdej przygotowanej próbki (lizaty komórek HepG2, lipoproteiny o niskiej gęstości, surowica ludzka) do każdej szklanej probówki.
2. Dodać 200 μl 8,1% SDS do każdej próbki i wzorca i delikatnie obracać szklaną probówkę okrężnymi ruchami, aby wymieszać próbkę.
3. Dodać 1,5 ml 3,5 M buforu octanu sodu (pH = 4) do każdej próbki i wzorca.
4. Dodać 1,5 ml 3,5 M buforu octanu sodu (pH = 4) do każdej próbki i wzorca.
5. Doprowadzić końcową objętość do 4 ml dla każdej próbki i wzorca, dodając 700 μl wody DI.
6. Szczelnie zakryj każdą szklaną probówkę i inkubuj w bloku grzewczym ustawionym na 95 °C przez 1 godzinę. Przykryj szklane rurki folią aluminiową, aby zapobiec kondensacji pary wodnej na górze probówek.
7. Wyjmij szklane rurki z bloku grzewczego i inkubuj na lodzie przez 30 minut.
8. Odwirować próbki i wzorce przy 1500 x g przez 10 minut w temperaturze 4 °C. Po odwirowaniu szklane probówki zawierające próbki i wzorce należy przechowywać w temperaturze RT.
   nuta: Utrzymywanie próbek na lodzie lub w temperaturze 4 °C spowoduje wytrącenie się całej próbki lub wzorca.
9. Natychmiast po odwirowaniu podamy 150 μl supernatantu z każdej probówki i umieścimy w oddzielnym dołku na 96-dołkowej płytce.
10. Usuń wszelkie pęcherzyki z każdej studzienki za pomocą końcówki pipety.
    nuta: Obecność pęcherzyków spowoduje niespójne odczyty absorbancji, co doprowadzi do wysokiej niedokładności testu.
11. Odczyt absorbancji przy 532 nm. Odjąć średni odczyt absorbancji próbek ślepych od wszystkich innych odczytów absorbancji.
12. Utwórz krzywą wzorcową, wykreślając odczyty absorbancji odjęte od ślepej próby przy 532 nm w porównaniu ze znanym stężeniem każdego wzorca. Dopasuj punkty danych przy użyciu regresji liniowej. Obliczyć nieznane stężenia próbki, korzystając z równania linii regresji liniowej uzyskanej z krzywej standardowej.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1x Sterylny PBS pH 7,4 1 L	VWR, PA	101642--262	Odczynnik do lizy komórek
Wolnostojąca probówka wirówkowa 50 ml	Corning, Nowy Jork	CLS430897	Materiał ogólny
Płytka 96-dołkowa, niepoddana obróbce, przezroczysta, z pokrywką, niejałowa	Thermo Fisher Naukowy, MA	280895	Do pomiaru absorbancji
Urządzenie z filtrem wirowym Amicon Ultra-0,5 100 kD	Fisher Scientific, NH	UFC510024	Oczyszczanie LDL
Zaślepki do rurek szklanych	Thermo Fisher Naukowy, MA	14-930-15D	Do oznaczania TBARS
Chlorek miedzi II	SIGMA, MO	222011-250G	Aby wywołać utlenianie
Probówki hodowlane, jednorazowe, z nakrętką, szkło borokrzemianowe (13 x 100 mm)	VWR, PA	Nr kat. 53283-800	Do oznaczania TBARS
Minimalna niezbędna pożywka firmy Eagle (EMEM)	ATCC, Wirginia	HB-8065	Pożywki komórkowe HepG2
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 1,5 ml	eppendorf, Nowy Jork	22363204	Materiał ogólny
Probówki Eppendorf Safe-Lock, 2,0 ml	Genesee Sceitific, Kalifornia	22363352	Materiał ogólny
Płodowa surowica bydlęca US Źródło	Omega Scientific, Kalifornia	FB-11	Do hodowli komórkowej
Lodowaty kwas octowy	SIGMA, MO	27225-1L-R	ODCZYNNIK TBARS
Koktajl inhibitora proteazy Halt (100x)	Thermo Scientific, MA	Numer katalogowy: 87786	Odczynnik do lizy komórek
HEPESY	SIGMA, MO	H3375-250G	Rozpuszczalnik LDL
Kwas solny (HCl)	Fisher Scientific, NH	A144-212	Odczynnik do lizy komórek
Wirówka Legend Micro 17	Thermo Scientific, MA	75002431	Materiał ogólny
Lipoproteina o niskiej gęstości, ludzkie osocze	Ateny Badania i Technologia, GA	12-16-120412	Prototyp matrycy biologicznej
Mieszadła magnetyczne, ośmiokąt 6-zestaw	VWR, PA	Nr kat. 58948-025	Materiał ogólny
dialdehyd malonowy bis (octan dimetylu)	SIGMA, MO	8207560250	TBARS Standardowy
Spektrofotometr mikropłytkowy Multiskan Go	Fisher Scientific, NH	51119200	Do pomiaru absorbancji
NP-40	EMD Millipore Corp, Massachusetts	492016-100ML	Odczynnik do lizy komórek
chlorek sodu	SIGMA, MO	S7653-1KG	Odczynnik do lizy komórek
Dodecylosiarczan sodu (SDS)	SIGMA, MO	Numer telefonu 436143-100G	ODCZYNNIK TBARS
wodorotlenek sodu	SIGMA, MO	367176-2,5 kg	ODCZYNNIK TBARS
Koncentrator SpeedVac	Thermo Scientific, MA	SC250EXP	Do zagęszczania lizatów komórkowych
Kwas tiobarbiturowy	SIGMA, MO	T5500-100G	ODCZYNNIK TBARS
Baza TRIS	Fluka, GA	Numer katalogowy: 93362	Odczynnik do lizy komórek

TGL powiedział: