$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie
- Dodać 5 ml penicyliny/streptomycyny (10000 j./ml) oraz 5 ml i 10 ml dostępnych w handlu suplementów do 500 ml kompletnej klasycznej pożywki z surowicą. Porcja 50 ml pożywki początkowo.
nuta: Nie należy wracać pożywki z powrotem do magazynu, aby uniknąć zanieczyszczenia.
- Umieść porcję kompletnego klasycznego podłoża na lodzie.
- Użyj 70% etanolu do czyszczenia mikroskopu preparacyjnego, kleszczy i nożyczek.
- Przygotuj dwie szalki do hodowli komórkowych (10 cm), jedną pod mikroskopem preparacyjnym, a drugą na lodzie; do każdej pożywki wlej 10 ml kompletnej klasycznej pożywki.
2. Etapy eksperymentalne (Rysunek 1)
- Uśmierc myszy C57BL / 6J około pourodzeniowego (P) 20 za pomocą 75-100 mg / kg ketaminy i 7,5 -10 mg / kg ksylazyny wstrzykiwanej dootrzewnowo. Trzymaj oczy w kompletnym klasycznym podłożu na lodzie przed preparacją.
- Usuń tkankę łączną (tkankę mięśniową i tłuszczową) oraz nerw wzrokowy na oku.
- Użyj mikronożyczek, aby przyciąć obwodowo 0,5 mm za rąbkiem rogówki. Usuń kompleks rogówki/tęczówki, ciało szkliste i soczewkę.
- Wykonaj nacięcie 1 mm prostopadle do krawędzi cięcia w kierunku nerwu wzrokowego i odetnij obwodową opaskę o szerokości 1 mm. Oddziel centralne i peryferyjne regiony kompleksu. Użyj kleszczy, aby odkleić siatkówkę od kompleksu RPE/naczyniówki/twardówki.
- Utrzymuj obwodową opaskę naczyniówki w kompletnym klasycznym podłożu na lodzie; odizoluj drugie oko i powtórz proces, aby przeciąć drugą prążek.
- Pokrój okrągłą opaskę na 6 ~ równych kwadratowych kawałków (~ 1 mm x 1 mm).
nuta: Nigdy nie dotykaj żadnej krawędzi.
- Rozmrozić podstawowy ekstrakt błonowy (BME) zgodnie z instrukcją producenta. Dodać 30 μl/basenik BME do środka każdego dołka 24-dołkowej płytki do hodowli tkankowej. Upewnij się, że kropla BME tworzy wypukłą kopułę na dnie płytki, nie dotykając krawędzi.
nuta: Rozmrozić BME przez noc w lodówce. BME powinien znajdować się na lodzie w dowolnym momencie po rozmrożeniu.
- Umieść tkankę na środku BME.
nuta: Nie spłaszczaj eksplantatu naczyniówki; ogólnie rzecz biorąc, pozwól tkance rozszerzać się w BME. Orientacja tkanki (twardówka do góry lub do dołu) nie ma wpływu na wynik eksperymentu.
- Inkubować płytkę w temperaturze 37 °C przez 10 minut, aby żel stężał.
- Dodać 500 μl kompletnego klasycznego podłoża/dołka.
- Zmieniaj klasyczną pożywkę co drugi dzień (500 μL). Kiełkowanie naczyniówki można zaobserwować po 3 dniach pod mikroskopem.
nuta: W przypadku leczenia czynnikiem wzrostu głodz tkankę przez 4 godziny. Rozcieńczyć badany związek w pożywce o obniżonym współczynniku wzrostu (wzmocnienie 1:200 zamiast 1:50).
3. Komputerowa metoda kwantyfikacji SWIFT-Choroid (Rysunek 2)
UWAGA: Użyto komputerowej metody pomiaru powierzchni pokrytej naczyniami uprawowymi. Przed kwantyfikacją potrzebna jest wtyczka makr do oprogramowania ImageJ.
- Otwórz obraz kiełkowania naczyniówki za pomocą ImageJ i zaznacz "Obraz |Rodzaj| 8-bitowy" ze skalą szarości.
- Przejdź do "Obraz | Dostosuj | Jasność/Kontrast (Ctrl/shift/ C)" i zoptymalizuj kontrast.
- Użyj funkcji magicznej różdżki, aby obrysować i usunąć z obrazu tkankę naczyniówki, która znajduje się w środku kiełków (za pomocą skrótu "F1") (Rysunek 2A, B).
nuta: Ustaw współczynnik tolerancji magicznej różdżki na 20-30%.
- Usuń tło obrazu za pomocą bezpłatnych narzędzi do zaznaczania (Rysunek 2C). Przejdź do "Obraz | Dostosuj | Próg (Ctrl/shift/T)". Użyj funkcji progowej, aby zdefiniować kiełki mikronaczyniowe na tle i na obrzeżach (rysunek 2D).
- Kliknij "F2", a pojawi się podsumowanie. Zapisz obraz wybranego obszaru, klikając "Zapisz". Zapisz go w tym samym folderze, co oryginalny obraz, aby móc z niego skorzystać w przyszłości.
- Po zmierzeniu grupy próbek skopiuj nagranie do analizy danych.
nuta: Możliwe jest również zmierzenie powierzchni (μm²) za pomocą opcji "Analizuj | Ustaw skalę" przy użyciu obrazów z paskami skali.
