Test aktywności reporterowej receptora estrogenowego w celu zbadania aktywności estrogenowej fitoestrogenów

Streszczenie

Źródło: Fender, E. et al., Badanie przesiewowe na obecność fitoestrogenów przy użyciu komórkowego receptora estrogenowego β testu reporterowego. J. Vis. Exp. (2021).

Ten film opisuje test reporterowy oparty na komórkach w celu określenia aktywności estrogenowej związków pochodzenia roślinnego. Związek o aktywności podobnej do estrogenu naśladuje jego wiązanie z receptorami estrogenowymi i napędza transkrypcję genów enzymu reporterowego. Enzym reporterowy generuje bioluminescencję w reakcji, co wskazuje na aktywność estrogenową związku.

Protokół

1. Test transfekcji ludzkiego receptora estrogenowego β

UWAGA: Technika aseptyczna i kaptur z przepływem laminarnym są wymagane do pierwszego dnia protokołu testu.

1. Przygotować rozcieńczenia 17β-estradiolu dla krzywej wzorcowej.
   1. Przenieś pożywkę do odzyskiwania komórek i złożoną pożywkę przesiewową (CSM) z zamrażarki i rozmroź je w łaźni wodnej o temperaturze 37 °C.
   2. Oznaczyć probówki do mikrowirówek Pośrednie 1 i 2 (INT1, INT2) oraz 1-8.
   3. Napełnij INT1 995 μl CSM, INT2 615 μl CSM, probówkę 1 900 μl CSM, a probówki 2-8 600 μl CSM. Odłóż rurkę 8 na bok.
   4. Przenieś 5 μl 100 μM 17β-estradiolu do INT1. Wyrzuć końcówkę. Wir.
   5. Przed każdym transferem przepłucz pipetę 3 razy, a następnie przenieś 10 μl z INT1 do INT2. Wyrzuć końcówkę.
   6. Przepłukać pipetę 3 razy, a następnie przenieść 100 μl z INT2 do probówki 1. Wyrzuć napiwek. Przenieść 300 μl z probówki 1 do probówki 2. Powtórz dla probówek od 3 do 7. Wyrzucić 300 μl z probówki 7 do pojemnika na odpady. Rurka 8 jest zerem i nie otrzymuje estradiolu. Końcowe stężenia platerowanych wzorców to: 400, 133,3, 44,44, 14,815, 4,938, 1,646, 0,5487 i 0 pM estradiolu.
2. Przygotować próbki związków.
   1. Próbki wirowe.
   2. Weź 4 μl każdej próbki rośliny w DMSO i dodaj do 496 μl CSM, aby uzyskać 0,8% roztwór DMSO.
3. Szybko rozmrozić komórki reporterowe.
   1. Pobrać probówkę z pożywką do odzyskiwania komórek z łaźni wodnej o temperaturze 37 °C. Zdezynfekuj powierzchnię zewnętrzną za pomocą 70% etanolu.
   2. Odzyskaj komórki reporterowe z magazynu w temperaturze -80 °C i rozmroź, przenosząc 10 ml wstępnie podgrzanego CRM do probówki z zamrożonymi komórkami.
   3. Zamknij probówkę z komórkami reporterowymi i przenieś je do łaźni wodnej o temperaturze 37°C na 5-10 minut.
   4. Wyjmij probówkę z zawiesiną komórek reporterowych z łaźni wodnej. Kilkakrotnie delikatnie odwróć rurkę komórkową, aby rozbić agregaty komórek i wytworzyć jednorodną zawiesinę. Oczyść powierzchnię rurki 70% etanolem.
4. Posiewanie testowe.
   1. Dozować 100 μl zawiesiny komórek reporterowych do każdej studzienki za pomocą pipety wielokanałowej.
   2. Dozować 100 μl próbek w trzech egzemplarzach do odpowiednich studzienek testowych.
   3. Przenieść płytkę do inkubatora o temperaturze 37 °C, nawilżonego 5% CO₂ na 22-24 godziny.
5. Rozmrozić substrat do wykrywania i bufor detekcyjny w ciemnej lodówce przez noc, aby przygotować się na Dzień 2.
6. Tuż przed zakończeniem inkubacji na płytce należy wyjąć z lodówki substrat detekcyjny i bufor detekcyjny i umieścić w miejscu o słabym oświetleniu, aż do uzyskania równowagi do temperatury słonecznej. Po osiągnięciu RT delikatnie odwróć każdą probówkę kilka razy, aby dokładnie wymieszać roztwory.
   1. Bezpośrednio przed zakończeniem inkubacji wlej całą zawartość buforu detekcyjnego do probówki z substratem detekcyjnym, aby utworzyć odczynnik do wykrywania lucyferazy. Delikatnie wymieszaj, aby nie wytworzyć piany.
   2. Po zakończeniu inkubacji odwrócić płytkę i wyrzucić jej zawartość do odpowiedniego pojemnika na odpady. Delikatnie postukaj płytką o czysty, chłonny ręcznik papierowy, aby usunąć ostatnie kropelki z dołków.
   3. Dodaj 100 μl odczynnika do wykrywania lucyferazy do każdej studzienki. Pozostawić płytkę testową w temperaturze pokojowej przez 15 minut. Nie potrząsaj talerzem.
7. Określ ilościowo luminescencję za pomocą 96-dołkowego luminometru do odczytu płytki.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Pipeta 1000 μL
Pipeta 20 μl
Pipeta 200 μl
Łaźnia wodna 37 °C
37 °C, nawilżany inkubator 5% CO2
70% etanolu
Waga analityczna
Okap z przepływem laminarnym przystosowany do hodowli komórkowych
Dimetylosulfotlenek
Jednorazowy zbiornik na media, sterylny
System filtracji kroplowej
Kolby Erlenmeyera			125 ml i 250 ml
Metanol klasy HPLC
System testów reporterowych dla ludzi ERβ, 1 x 96-dołkowe testy	Nauki biologiczne indygo	IB00411	Zestaw testowy - analizuje 24 próbki plus krzywa wzorcowa
Liofilizator
Pipeta wielokanałowa
Wytrząsarka orbitalna
Luminometr do odczytu płytowego			np. Bioteck Synergy HTX
Parownik obrotowy
Kolby okrągłodenne			50 ml i 300 ml
Sterylne probówki do mikrowirówek lub sterylne wielokanałowe zbiorniki na media
Sterylne końcówki			200 μL oraz 1000 μL
Papier klasy 1 Whatmana
Worki Whirl-pak			sterylne worki polietylenowe