Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Izolacja i hodowla ludzkich neuronalnych komórek progenitorowych (hNPC)
- Umieść tkankę mózgową na szalce Petriego o średnicy 100 mm i ostrożnie usuń opony mózgowe za pomocą kleszczy.
- Przenieś tkankę mózgową do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i umyj ją dwukrotnie 20 ml PBS, delikatnie odwracając probówkę.
- Inkubować tkankę mózgową w nowej stożkowej probówce o pojemności 50 ml, zanurzając tkankę w roztworze dysocjacji komórek (patrz tabela materiałów) i DNazie I (10 U/ml) przez 10 minut w temperaturze 37 °C.
- Dodać 5 ml pożywki do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów) do probówki zawierającej tkankę mózgową i mechanicznie dysocjować neurosfery poprzez rozcieranie 20 do 30 razy przez końcówkę pipety o pojemności 1000 μl, aby uzyskać zawiesinę jednokomórkową.
- Przefiltruj zawiesinę komórek przez sitko o wielkości 70 μm, aby usunąć skupiska komórek.
- Wysiewać zawiesinę jednokomórkową w wentylowanej kolbie T-25 z 5-10 ml pożywki do hodowli komórek nerwowych uzupełnionej składnikami wyszczególnionymi w tabeli 1.
- Wysterylizuj roztwór heparyny przez filtrację przez filtr 0,2 μm. Suplement B-27 bez witaminy A jest suplementem bez surowicy do hodowli progenitorów nerwowych i komórek macierzystych bez wywoływania różnicowania.
nuta: Ludzkie nerwowe komórki progenitorowe (hNPC) są izolowane z ludzkiego mózgu płodu pobranego od abortowanego płodu. Po 7–10 dniach hodowli nerwowe komórki macierzyste (NSC) tworzą swobodnie unoszące się kolonie neurosfery, podczas gdy inne typy komórek pozostają w zawieszeniu jako pojedyncze komórki lub przyczepiają się do dna kolby. Wyizolowane hNPC mogą być hodowane jako neurosfery w zawieszeniu przez kilka miesięcy.
2. Przekazywanie hNPC
- Zebrać pożywkę zawierającą pływające kulki, duże i małe neurosfery, i przenieść je do stożkowej probówki o pojemności 50 ml.
nuta: Z nieznanych przyczyn czas rozszczepienia neurosfer jest zmienny od 7 dni do 30 dni. Jednak ogólnie rzecz biorąc, neurosfery muszą być pasażowane, gdy osiągną średnicę większą niż 700-900 μm. Dzieje się tak, gdy środek neurosfery zaczyna ciemnieć, co jest uważane za oznakę wysokiego tempa śmierci komórki.
- Wirować neurosfery przez odwirowanie przy 300-400 x g przez 3 minuty.
- Ostrożnie odessać supernatant, a następnie zanurzyć kulki w 500 μl odczynnika do dysocjacji rozmrożonych komórek (patrz tabela materiałów).
- Przygotować porcje odczynnika do dysocjacji komórek, dodając 500 μl na 1,5 ml mikroprobówek i przechowywać w temperaturze -20 °C. Aby uniknąć utraty aktywności enzymatycznej, należy rozmrozić odczynnik do dysocjacji komórek, trzymając go w temperaturze pokojowej lub w cieple przez 5 minut w kąpieli wodno-perełkowej o temperaturze 37 °C.
- W zależności od gęstości i wielkości kulek, zanurzone kule inkubować w temperaturze 37 °C przez 5-15 minut.
- Dodaj 5-10 ml wstępnie podgrzanej pożywki hodowlanej do neurosfer zawierających 50 ml stożkowej probówki i odwiruj przy 300-400 x g przez 5 minut, aby osadzać neurosfery.
- Odessać supernatant i delikatnie pipetować w górę i w dół, za pomocą pipety 1000 μl, w 2 ml pożywki hodowlanej, aż wszystkie neurosfery znajdą się w zawiesinie jednokomórkowej.
nuta: Dysocjacja stanie się widoczna gołym okiem. Przed dysocjacją neurosfery mają postać sfer. Po zanurzeniu w odczynniku dysocjacyjnym i pipetowaniu w górę iw dół, staną się pojedynczymi komórkami.
- Policz i płytkuj pojedyncze komórki, od 2 do 3 milionów komórek na kolbę T-25, w 10 ml pożywki hodowlanej.
- Karm komórki co 3 dni, wymieniając połowę pożywki hodowlanej.
- Uspokój neurosfery, pochylając kolbę tak, aby znajdowała się w dolnym rogu. Trzymać kolbę w tej pozycji przez około 1-2 minuty, aż neurosfery opadną. Następnie delikatnie odessać połowę pożywki, wkładając pipetę serologiczną do pożywki powyżej osadzonych neurosfer. Zdysocjowane komórki mogą agregować się, tworząc kule po 2 do 3 dniach w hodowli.
3. Zamrażanie hNPC
- Przygotować pożywkę do zamrażania komórek, dodając DMSO do pożywki hodowlanej do końcowego stężenia 10% (v/v) lub użyć dostępnej w handlu pożywki do krioprezerwacji dla wrażliwych typów komórek (patrz tabela materiałów).
- Posortuj duże kule, przenosząc pożywkę do stożkowej rurki o pojemności 50 ml i pozwalając kulkom osiąść grawitacyjnie. Następnie wyjmij i przenieś duże neurosfery do nowej stożkowej probówki o pojemności 50 ml w celu pasażowania za pomocą końcówki do pipety o pojemności 200 lub 1000 μl.
nuta: Neurosfery o średnicy większej niż 900 μm są uważane za duże, a te o średnicy mniejszej niż 500 μm są uważane za małe.
- Pozostałe neurosfery odwirować przez odwirowanie w stężeniu 300-400 x g przez 3 min. Ostrożnie usunąć supernatant.
- Ponownie zawiesić do 100 kulek w 1 ml odczynnika do kriokonserwacji i przenieść go do krioprobówki.
- Przechowywać przez noc w temperaturze -80 °C w pojemniku do zamrażania komórek (patrz Tabela materiałów) i następnego dnia przenieść do ciekłego azotu w celu długotrwałego przechowywania.
nuta: Zaleca się zamrażanie małych i średnich neurosfer (o średnicy mniejszej niż 900 μm) i unikanie zamrażania dużych neurosfer (o średnicy większej niż 900 μm) lub pojedynczych komórek. Aby zmniejszyć uszkodzenia komórek podczas rozmrażania próbki, utrzymuj gęstość komórek, umieszczając rozmrożone neurosfery w małej kolbie T25.
4. Ocena neurotoksyczności
UWAGA: Cytotoksyczność badanych związków jest oceniana na płytkach 384-dołkowych (patrz Tabela materiałów) przy użyciu testu żywotności komórek luminescencyjnych (patrz Tabela materiałów). hNPC są przygotowywane według tej samej metody, z wyjątkiem niewielkich modyfikacji, opisanych w sekcji "Różnicowanie i leczenie hNPC". Następnie mierzy się sygnał luminescencyjny generowany przez test żywotności komórek luminescencyjnych za pomocą czytnika mikropłytek. Sygnał luminescencyjny jest proporcjonalny do stężenia komórkowego ATP, które samo w sobie jest wprost proporcjonalne do liczby żywotnych komórek obecnych w każdym dołku.
- powłoka
- Dodać 30 μl poli-L-lizyny (PLL) na dołek płytki 384-dołkowej.
- Inkubować przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Umyj 2x PBS.
- Pozostaw do wyschnięcia w temperaturze pokojowej (przez około 30 minut).
- Dodać 30 μl lamininy (50 μg/ml) na dołek płytki 384-dołkowej.
- Inkubować przez 2 godziny w temperaturze 37 °C.
- Umyj 2x z PBS.
nuta: Powlekane płytki 384-dołkowe można przechowywać w temperaturze 4 °C przez 1 miesiąc.
- Posiewanie ogniw
- Policz i umieść 20 000 neurosfer jednokomórkowych na dołku 384-dołkowej płytki w 25 μl pożywki różnicowej.
- Inkubować przez 5 dni w temperaturze 37 °C.
- Po 5 dniach poddać komórki działaniu przez 24 godziny za pomocą badanych związków przygotowanych w stężeniu 6-krotnie większym niż końcowe pożądane stężenie w objętości 5 μl (aby uzyskać końcową objętość 30 μl na studzienkę).
- Test żywotności komórek
- Dodać 30 μl odczynnika do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych na dołek płytki 384-dołkowej.
nuta: Dodać objętość odczynnika do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych równą objętości obecnej w każdym dołku. Rozmrozić odczynnik do oznaczania żywotności komórek luminescencyjnych i zrównoważyć go z RT przed użyciem.
- Wstrząsać na talerzu przez 2 minuty (w celu wymieszania i wywołania lizy komórek).
- Odwirować mieszaninę przez odwirowanie przy 300-400 x g przez 30 s.
- Inkubować 384-dołkową płytkę przez 10 minut w temperaturze pokojowej w miejscu chronionym przed światłem (w celu ustabilizowania sygnału luminescencyjnego).
- Rejestruj luminescencję za pomocą czytnika mikropłytek.
nuta: Stosować odpowiednie kontrole do oznaczania żywotności, w tym Velcade (o końcowym stężeniu 10 μM) jako dodatni i HBSS zawierający DMSO (o stężeniu końcowym 0,1% lub 0,2%) jako kontrolę ujemną.
Tabela 1. Składniki niezbędne do wytworzenia 100 ml pożywki hodowlanej
| kwota | składnik |
| 100 μL | EGF (20 ng/ml) |
| 100 μL | FGF (10 ng/ml) |
| 2 ml | B-27, minus witamina A (50X) |
| 1 ml | L-alanylo-L-glutamina (100X) (patrz tabela materiałów) |
| 4 μl | Heparyna (2 μg/ml) |
| 96,8 ml | Pożywka do hodowli komórek nerwowych (patrz tabela materiałów) |
