$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przejściowa transfekcja plazmidów ekspresyjnych do komórek
- Zbierz przylegający HEK293T hodowli komórkowej przez trypsynizację i ponownie zawieś komórki w dedykowanym, kompletnym pożywce wzrostowej. Umieść komórki (2 x 104/100 μl/dołek) na przezroczystej, białej płytce 96-dołkowej. Dostosuj całkowitą liczbę studzienek, aby pomieścić wszystkie badane kombinacje i kontrole, w tym kontrpróby.
nuta: Staraj się używać tylko wewnętrznych 60 dołków płyty, aby zminimalizować przesunięcia termiczne i uniknąć parowania przez noc. Zdecydowanie zaleca się stosowanie płytek pokrytych poli-D-lizyną, takich jak te wskazane w tabeli materiałów, w przeciwnym razie komórki mogą się odkleić podczas kolejnych etapów mycia.
- Hodować komórki przez noc w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ).
- Następnego dnia przetransfekuj komórki pożądanymi kombinacjami plazmidów ekspresyjnych.
- Rozcieńczyć plazmidy ekspresyjne w podłożu bez surowicy (patrz tabela materiałów) do 6,25 ng / μl dla każdego konstruktu.
- Dodać odczynnik do transfekcji na bazie lipidów w odpowiednim stosunku lipidów do DNA i inkubować zgodnie z instrukcjami producenta.
- Dodać 8 μl mieszaniny lipid-DNA do wyznaczonych studzienek. Wymieszaj zawartość talerza, delikatnie obracając. Powoduje to transfekcję obu konstruktów ekspresji przy 50 ng/basenie.
- Hodować komórki przez 20-24 godziny w standardowych warunkach (37 °C, 5% CO2 ).
nuta: Hodowla komórek przez dłuższy czas może skutkować wyższymi poziomami ekspresji białek fuzyjnych, co może sprzyjać niespecyficznemu skojarzeniu między fragmentami.
2. Średnia wymiana
- Następnego dnia zastąp kondycjonowaną pożywkę 100 μl pożywki wolnej od surowicy w każdym dołku. Upewnij się, że ogniwa nie odczepiły się po wymianie nośnika.
nuta: Ten krok należy wykonać 2-3 godziny przed dodaniem roztworu roboczego furimazyny. Odstawienie surowicy minimalizuje tło spowodowane autoluminescencją furimazyny.
3. Przygotowanie roztworu roboczego furimazyny
- Tuż przed pomiarem zmieszać 1 objętość furimazyny z 19 objętościami buforu rozcieńczającego (rozcieńczenie 20-krotne).
nuta: Całkowita objętość roztworu roboczego furimazyny, który ma być przygotowany, zależy od liczby pojedynczych studzienek, które mają być analizowane (roztwór roboczy furimazyny dodaje się do pożywki do hodowli komórkowej w stosunku 1:5, dlatego do każdej studzienki uprzednio wypełnionej 100 μl pożywki wolnej od surowicy należy dodać 25 μl roztworu roboczego furimazyny).
- Dodać roztwór roboczy furimazyny do wyznaczonych studzienek (25 μl/studzienkę). Delikatnie wymieszaj płytkę ręcznie lub za pomocą wytrząsarki orbitalnej (np. 15 s przy 300-500 obr./min).
4. Pomiar luminescencji
- Włóż płytkę do czytnika mikropłytek luminescencyjnych.
- W przypadku doświadczeń, które mają być przeprowadzone w temperaturze 37 °C, należy zrównoważyć płytkę przez 10-15 minut we wskazanej temperaturze.
- Wybierz studnie, które mają zostać przeanalizowane.
- Odczyt luminescencji z czasem integracji wynoszącym 0,3 s. W razie potrzeby kontynuuj monitorowanie luminescencji przez maksymalnie 2 godziny.