Test elektrochemiluminescencji do ilościowego oznaczania docelowych poziomów białka w lizacie mózgu

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE

1. Protokół MeCP2-ECLIA

1. Przygotowanie roztworu myjącego, buforu blokującego i roztworu rozcieńczalnika do oznaczania (dzień 1)
   1. Dodaj 500 μL Tween 20 do 1 L PBS, aby przygotować 0,05% roztwór Tween 20 in PBS, energicznie wymieszaj i oznacz jako "roztwór myjący".
      nuta: Upewnij się, że używany jest tylko świeżo przygotowany bufor do mycia.
   2. Przygotować roztwór blokujący 3% blokera A (tabela materiałów) w roztworze soli fizjologicznej buforowanym fosforanami (PBS). Wymieszaj delikatnie mieszając, przefiltruj, wysterylizuj i przechowuj w lodówce do czasu użycia przez maksymalnie dwa tygodnie.
   3. Dodać 5 ml roztworu blokującego do 10 ml PBS, aby przygotować roztwór rozcieńczalnika do oznaczania (1% bloker A w PBS).
2. Powlekanie płyt o wysokim stopniu wiązania
   1. Wyjmij 96-dołkową, wielomacierzową, jednopunktową płytkę o wysokim wiązaniu.
      nuta: Płyty o wysokim spoiwa mają większą zdolność wiązania, a tym samym większy zakres dynamiki niż standardowe płyty z powierzchniami hydrofobowymi.
   2. Rozmrozić mysie przeciwciało monoklonalne anty-MeCP2 na lodzie i zmieszać 0,67 μl przeciwciała z 4 ml PBS (rozcieńczenie przeciwciała 1:6 000 w PBS). Zmieszaj roztwór przeciwciała, aby dobrze wymieszał i oznacz probówkę jako "roztwór powlekający".
   3. Ostrożnie dozować 25 μl roztworu powlekającego w dolnym rogu każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego; nazywa się to metodą powlekania roztworem. Delikatnie postukaj w 96-dołkową płytkę z każdej strony, aby upewnić się, że roztwór powlekający pokrywa dno każdej studzienki.
   4. Uszczelnić płytkę folią samoprzylepną i inkubować płytkę w lodówce w temperaturze 4 °C przez noc (12−16 godzin).
3. Blokowanie (dzień 2)
   1. Wyjmij talerz z lodówki i zdejmij folię.
   2. Usuń roztwór powlekający przeciwciało, wrzucając go do kosza na śmieci i postukaj płytką o ręcznik papierowy, aby usunąć cały roztwór powlekający z dołków.
   3. Dodać 125 μl roztworu blokującego do studzienki. Ponownie uszczelnij płytkę i umieść ją na orbitalnej wytrząsarce do mikropłytek.
   4. Inkubować płytkę przez 90 minut w temperaturze pokojowej ze stałym wytrząsaniem przy 800 obr./min.
4. Przygotowanie wzorców i próbek
   1. W czasie inkubacji należy przygotować wzorce białkowe MeCP2 i/lub TAT-MeCP2 oraz różne próbki.
      nuta: Bufor do lizy stosowany do rozcieńczania wzorcowego musi być taki sam, jak stosowany w analizowanych próbkach.
   2. Wyjąć jedną fiolkę z roztworem podstawowym białka MePC2 i/lub TAT-MeCP2 (250 μg/ml), lizatami mózgu myszy i lizatami HDF w temperaturze od -80 °C. Rozmrozić je na lodzie.
   3. Rozcieńczyć wzorcowy roztwór podstawowy (MeCP2 i/lub TAT-MeCP2) w czystych probówkach zgodnie z tabelą 1.
   4. Rozcieńczyć próbki w buforze do lizy w następujący sposób: 1−20 μg lizatu mózgu myszy na 25 μl buforu do lizy i 0,25−1 μg lizatu HDF na 25 μl buforu do lizy. Przygotować objętość każdej próbki wystarczającą do przeprowadzenia analizy w trzech egzemplarzach.
5. Dodawanie próbek i roztworów wzorcowych
   1. Usuń roztwór blokujący, wrzucając go do kosza na śmieci i postukaj talerzem o ręcznik papierowy, aby usunąć cały roztwór blokujący z dołków.
   2. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.
   3. Dodaj 25 ul wzorców i próbek do dolnego rogu studzienki za pomocą pipety jednokanałowej.
   4. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 4 godziny w temperaturze pokojowej, stale wstrząsając przy 800 obr./min.
6. Nieznakowane przeciwciało wykrywające
   1. Rozmrozić poliklonalne królicze przeciwciało anty-MeCP2 na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:6 000 w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania.
   2. Wyjmij wzorce i próbki, wrzucając je do kosza na śmieci i postukając talerzem o ręcznik papierowy.
   3. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.
   4. Dodać 25 μl nieznakowanego przeciwciała detekcyjnego do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować ją przez 1 godzinę z ciągłym wstrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze pokojowej.
7. Swoiste przeciwciało sprzężone
   1. Wyjmij określone przeciwciało drugorzędowe (tabela materiałów) z lodówki i umieść je na lodzie. Rozcieńczyć przeciwciało w stosunku 1:666.67 w roztworze rozcieńczalnika do oznaczania i delikatnie wymieszać.
   2. Usuń wolne, nieoznakowane przeciwciało drugorzędowe, wrzucając je do kosza na śmieci i postukając w płytkę o ręcznik papierowy.
   3. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego, dodając roztwór myjący i natychmiast go usuwając.
   4. Dodać 25 μl specyficznego sprzężonego przeciwciała (tabela materiałów) do każdej studzienki za pomocą pipetora wielokanałowego. Uszczelnić płytkę i inkubować przez 1 godzinę z ciągłym wytrząsaniem przy 800 obr./min w temperaturze pokojowej.
8. Odczytywanie tabliczki
   1. Usuń wolne sprzężone przeciwciało (tabela materiałów), wrzucając je do kosza na śmieci i postukając płytką o ręcznik papierowy.
   2. Umyj płytkę 3x 150 μL roztworu myjącego.
   3. Dodaj 150 μl 1x bufor do odczytu złota na bazie Tris (tabela materiałów) ze środkiem powierzchniowo czynnym zawierającym tripropyloaminę jako koreagent do wytwarzania światła do płytki. Należy unikać pęcherzyków powietrza, stosując techniki pipetowania wstecznego.
   4. Umieść płytkę na platformie do wykrywania mikropłytek (Tabela materiałów) i natychmiast rozpocznij pomiar. Użyj ustawień do akwizycji płytki 96-dołkowej.
   5. Przechwytywanie sygnałów elektrochemiluminescencyjnych przez wbudowaną kamerę CCD w systemie detekcji elektrochemiluminescencji (Tabela materiałów) i rejestrowanie liczby sygnałów, które odpowiadają względnym jednostkom światła (RLU) i są wprost proporcjonalne do natężenia światła.
      nuta: Po stymulacji elektrochemicznej etykieta rutenu związana z elektrodą węglową emituje światło luminescencyjne o długości fali 620 nm. Analizuj dane za pomocą oprogramowania dołączonego do przyrządu (tabela materiałów).

Tabela 1: Standardowe serie od 0 do 1,800 ng/ml.