Niniejszy protokół opisuje metodę obrazowania fluorescencyjnych limfocytów T wprowadzonych do przekrojów węzła chłonnego. Technika ta umożliwia analizę migracji limfocytów T w czasie rzeczywistym przy użyciu tradycyjnych mikroskopów fluorescencyjnych w szerokim polu lub mikroskopów konfokalnych.
Artykuł metodologiczny
Obrazowanie ex vivo limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych myszy z wykorzystaniem mikroskopii szerokopolowej i konfokalnej
W tym artykule
Podsumowanie
Streszczenie
Naiwne limfocyty T stale migrują do wtórnych narządów limfatycznych, w tym do obwodowych węzłów chłonnych, w celu wykrycia rzadko ekspresywnych antygenów. Migracja limfocytów T do węzłów chłonnych jest złożonym procesem, w którym uczestniczą czynniki komórkowe i chemiczne, w tym chemokiny. W ostatnim czasie zastosowanie mikroskopii dwufotonowej umożliwiło śledzenie limfocytów T w nienaruszonych węzłach chłonnych oraz uzyskanie ilościowych informacji na temat ich zachowania i oddziaływań z innymi komórkami. Choć system in vivo oferuje oczywiste zalety, podejście to wymaga złożonej i kosztownej aparatury oraz zapewnia ograniczony dostęp do tkanki. Aby przeanalizować zachowanie limfocytów T w mysich węzłach chłonnych, opracowaliśmy test na skrawkach tkankowych 1, pierwotnie opracowany przez neurobiologów, a niedawno zaadaptowany do badań nad mysim grasicą 2. W tej technice limfocyty T znakowane fluorescencyjnie są nakładane na świeżo przygotowany skrawek węzła chłonnego. W niniejszym artykule wideo lokalizacja i migracja limfocytów T do tkanki są analizowane w czasie rzeczywistym za pomocą mikroskopu szerokopolowego oraz konfokalnego. Technika ta, uzupełniająca mikroskopię dwufotonową in vivo, stanowi skuteczną metodę obrazowania limfocytów T w ich naturalnym środowisku oraz wyjaśniania mechanizmów leżących u podstaw migracji limfocytów T.
Protokół
1. Przygotowanie skrawków z węzłów chłonnych
- Przygotować 4% roztwór niskotopliwej agarozy do zatapiania. Rozpuścić agarozę w PBS i podgrzać roztwór w kuchence mikrofalowej. Po całkowitym rozpuszczeniu agarozy utrzymywać roztwór w temperaturze 37°C do momentu użycia.
- Przygotować 6-dołkową płytkę do hodowli tkankowej. Do każdej dołki dodać 1,1 ml kompletnej pożywki RPMI i włożyć wkład do hodowli organotypowej. Płytkę 6-dołkową przechowywać w temperaturze 4°C do czasu przeniesienia skrawków.
- Umieścić stalowe podkładki o średnicy wewnętrznej 4 mm w plastikowym naczyniu wypełnionym kompletną pożywką RPMI. Podkładki posłużą w dalszej kolejności do zagęszczenia komórek na skrawku wyciętym w wibrotomie.
- Uśmiercić mysz zgodnie z lokalnymi przepisami dotyczącymi dobrostanu zwierząt. Ostrożnie usunąć obwodowe węzły chłonne z otaczających tkanek i umieścić je w plastikowym naczyniu zawierającym lodowaty PBS. Należy zachować szczególną ostrożność, aby nie uszkodzić struktury węzła chłonnego, ponieważ organy te są bardzo miękkie.
- Wlać 4% żel agarozowy do 35-milimetrowego plastikowego naczynia i delikatnie przenieść węzły do żelu. Pozostawić żel agarozowy na lodzie przez 5 min w celu jego stwardnienia.
- Wyjąć blok z naczynia i przyciąć agar tak, aby wokół każdego węzła chłonnego pozostało 3-5 mm żelu.
- Przymocować zatopione węzły do dysku na próbki wibrotomie za pomocą nietoksycznego kleju tkankowego. Zamontować dysk w tacku wypełnionym lodowatym PBS.
- Wyciąć skrawki tkanki zatopionej w agarze o grubości 320 μm, ustawiając prędkość wibrotomu na zakres niski (0,3 mm/s) oraz częstotliwość wibracji na zakres średni (1,5 mm).
- Ostrożnie przenosić skrawki węzła chłonnego bezpośrednio po wycięciu na wkładki do hodowli organotypowej za pomocą precyzyjnej pincety. Na każdą wkładkę położyć 3 skrawki. Należy zachować szczególną ostrożność, ponieważ skrawki mogą zostać łatwo uszkodzone. Typowy obwodowy węzeł chłonny daje 5 skrawków przy cięciu o grubości 320 μm. Odrzucić pierwszy i ostatni skrawki, ponieważ zawierają one jedynie tkankę powierzchniową.
- Na każdym pojedynczym skrawku umieścić stalową podkładkę. Upewnić się, że podkładki są dobrze rozmieszczone na agarozie otaczającej tkankę.
- Inkubować płytkę hodowlaną w temperaturze 37°C w wilgotnej inkubatorze z 5% CO2 do momentu wysiania limfocytów T.
2. Izolowanie limfocytów T z węzłów chłonnych myszy
- Wyizoluj limfocyty T zgodnie z wcześniej opublikowanym artykułem JoVE 3.
- Należy niezwłocznie wykorzystać limfocyty T i przejść do następnej sekcji. W przeciwnym razie limfocyty można hodować przez noc w pełnej pożywce RPMI uzupełnionej o 10 ng/ml IL-7.
3. Znakowanie wyizolowanych limfocytów T
- Przemyć komórki w HBSS. Resuspendować je w tym samym buforze w stężeniu 10 x 106 na ml.
- Dodać taką samą objętość buforu HBSS zawierającego 1 μM Cell Tracker Green CMFDA, zapewniający stężenie końcowe wynoszące 0.5 μM.
- Inkubować zawiesinę komórkową w temperaturze 37°C przez 5 min. Przemyć komórki dwukrotnie pełnym medium RPMI.
- Resuspendować komórki do końcowego stężenia 10 x 106 na ml w pełnym medium RPMI. Te znakowane komórki zostaną wysiane na skrawki.
Można stosować również inne barwniki fluorescencyjne niż CMFDA, jednak należy pamiętać, że cząsteczki te mogą być toksyczne powyżej określonych stężeń.
4. Wysiewanie znakowanych limfocytów T na plastry węzłów chłonnych
- Za pomocą pipety usuń nadmiar pożywki znajdującej się w wewnętrznej części przemywacza. Nie dopuść do wyschnięcia tkanki; wykonaj ten krok szybko.
- Ostrożnie nanieś do wewnętrznej części przemywacza od 10 do 20 μl zawiesiny oznakowanych limfocytów T, co odpowiada 1 do 2 x 105 komórek. Należy uważać, aby końcówka pipety nie dotknęła tkanki. Upewnij się, że kropla zawiesiny komórkowej pozostała na swoim miejscu.
- Umieść skrawki z komórkami w inkubatorze w temperaturze 37°C i przy 5% CO2 na co najmniej 30 min, aby umożliwić migrację limfocytów do tkanki.
5. Obrazowanie limfocytów T w przekrojach węzłów chłonnych
W niniejszym artykule wideo obrazujemy fluorescencyjne limfocyty T w przekrojach węzłów chłonnych, korzystając z odwróconego mikroskopu szerokopolowego oraz pionowego mikroskopu konfokalnego.
- Ustaw temperaturę na 37°C. Nasze mikroskopy są wyposażone w komory z kontrolą temperatury.
- Zainstaluj system perfuzyjny umożliwiający ciągłą perfuzję skrawka węzła chłonnego natlenionym (5% CO2, 95 % O2) ośrodkiem RPMI bez czerwieni fenolowej. W naszym systemie perfundowane medium wpływa do komory obrazowania z jednej strony siłą grawitacji. Medium jest odsysane pompą podłączoną do kolby na odpady. Ustaw szybkość przepływu medium na 1 ml/min.
- Za pomocą precyzyjnej pęsety delikatnie wyjmij skrawek z płytki 6-dołkowej i zanurz preparat na kilka sekund w ogrzanym, natlenionym ośrodku RPMI, aby usunąć komórki fluorescencyjne, które nie przeniknęły do tkanki.
Obrazowanie limfocytów T przy użyciu odwróconego mikroskopu w polu szerokim
- Umieść skrawek odwrócony do góry dnem w specjalnie wykonanej komorze obrazującej, która składa się z nici nylonowych przyklejonych do wewnętrznej części naczynia z szklanym dnem. W tej komorze nici nylonowe unoszą skrawek nad szkło i umożliwiają dyfuzję natlenionego roztworu do tkanki. Jest to niezbędne, ponieważ migracja limfocytów T w węzłach chłonnych jest silnie zależna od tlenu. Zabeziecz skrawek, nakładając na niego stalową podkładkę. W takich warunkach skrawek znajduje się kilka mikronów nad dnem naczynia, co ułatwia wymianę roztworu perfuzyjnego.
- Aby uchwycić szerokie pole widzenia (80 x 80 μm, co stanowi około jednej trzeciej powierzchni skrawka węzła), wykonaj obrazy przy użyciu suchego obiektywu 10x. Ustaliliśmy, że obiektyw 10x Nikon S fluor 0.5 NA był najbardziej odpowiedni dla naszych analiz.
Typowy eksperyment obrazowania time-lapse obejmuje rejestrację 5 płaszczyzn optycznych, które w wymiarze osiowym (z) pokrywają łącznie głębokość 50 μm. Fluorescencyjne limfocyty T są zazwyczaj obrazowane w odstępach od 10 do 30 sekund w ciągu 10 do 20 min.
Obrazowanie limfocytów T za pomocą konfokalnego mikroskopu pionowego
Mikroskop konfokalny wykorzystany w tym protokole to Leica SP5 wyposażony w obiektyw imersyjny wodny 20x (Olympus, 20x/0.95 NA).
- Przymocuj skrawek do stolika obrazującego mikroskopu. Uwaga: Zazwyczaj kładziemy na preparacie podkładkę, aby go unieruchomić.
- Ustaw sesję obrazowania, zbierając serię obrazów wzdłuż osi z. Aby obrazować limfocyty T w nienaruszonej strukturze tkanki, pozycję początkową zazwyczaj ustawia się od 5 do 10 μm poniżej pierwszego oznakowanego limfocytu T.
6. Reprezentatywne wyniki
Postępując zgodnie z tym protokołem wideo, należy spodziewać się wizualizacji licznej grupy fluorescencyjnych limfocytów T nagromadzonych w strefie T węzła, co jest zjawiskiem występującym normalnie w tym konkretnym środowisku in vivo (Rycina 1). W szczególności limfocyty T powinny być wykluczone ze stref limfocytów B, które zazwyczaj znajdują się bezpośrednio pod torebką. Pomyślny eksperyment doprowadzi również do rekrutacji limfocytów T do tkanki (Rycina 2), wykazujących wysoką ruchomość (Rycina 3), co jest zgodne z opublikowanymi wynikami uzyskanymi w nienaruszonych węzłach chłonnych 4. Średnio średnia prędkość poszczególnych limfocytów T w obrębie skrawków powinna wynosić blisko 10 μm/min (Rycina 4).
Rycina 1. Akumulacja limfocytów T w przekroju węzła chłonnego. Do plastra węzła chłonnego dodano znakowane fluorescencyjnie limfocyty T (CMFDA, zielony) na 30 minut przed akwizycją obrazu (zdjęcie górne). Obraz stanowi projekcję maksymalną 5 obrazów obejmujących 50 μm w kierunku osi z. Obraz w jasnym polu przedstawiono na dole. Obrazy zarejestrowano przy użyciu mikroskopu szerokopolowego.
Rycina 2. Limfocyty T są rekrutowane do przekroju węzła chłonnego. T-limfocyty znakowane fluorescencyjnie (CMFDA, zielony) dodano do przekroju węzła chłonnego 30 minut przed wykonaniem obrazowania za pomocą mikroskopu konfokalnego. Obrazy zarejestrowano na powierzchni cięcia (górne zdjęcie) oraz 40 μm poniżej (dolne zdjęcie).
Rycina 3. Limfocyty T wykazują wysoką ruchliwość w przekroju węzła chłonnego. Przez 12 min obrazowano znakowane fluorescencyjnie limfocyty T przy użyciu mikroskopu szerokopolowego. Trajektorie poszczególnych limfocytów T przedstawiono jako ścieżki zakodowane kolorystycznie, gdzie przejście od koloru niebieskiego (komórki o niskiej ruchliwości) do czerwonego (komórki o wysokiej ruchliwości) reprezentuje zwiększone przemieszczenie. Ścieżki obliczono przy użyciu oprogramowania Imaris. Biała linia wyznacza krawędź węzła, natomiast przerywany owal odgranicza domniemaną strefę limfocytów B.
Rycina 4. W obrębie przekroju węzła chłonnego prędkość limfocytów T jest bliska 10 μm/minPrędkości obliczono za pomocą oprogramowania Imaris na podstawie ścieżek przedstawionych na rysunku 3.
Dyskusja
Opisaliśmy prostą, szybką i niezawodną technikę przygotowywania przekrojów węzłów chłonnych, które są wykorzystywane do badania zachowania wprowadzonych limfocytów T. W ostatnich latach metoda ta była z sukcesem stosowana w przypadku przekrojów grasicy i węzłów chłonnych w celu zidentyfikowania czynników zewnątrzkomórkowych kontrolujących pozycjonowanie i ruchliwość limfocytów T 1,5. Wykorzystywano ją również do pomiaru odpowiedzi Ca2+ w tymocytach podczas selekcji pozytywnej oraz w limfocytach T po rozpoznaniu antygenu 2,6. Test z nałożonymi przekrojami (overlay slice assay) wykazuje zalety i ograniczenia, które zasługują na omówienie. Warto zauważyć, że system ten umożliwia dostęp do tkanki, co jest przydatne w przypadku konieczności farmakologicznego manipulowania przekrojami w celu ingerencji w molekularną kontrolę migracji komórek. Po obrazowaniu przekroje mogą zostać poddane immunohistochemii, aby zebrać dalsze informacje o obrazowanych strukturach. Ponadto obserwacje można prowadzić przy użyciu tradycyjnego fluorescencyjnego mikroskopu szerokopolowego. Chociaż rozdzielczość nie jest tak dobra jak w przypadku mikroskopu konfokalnego lub dwufotonowego, a fototoksyczność jest w zasadzie silniejsza w mikroskopii jednofotonowej niż dwufotonowej, metoda ta ma zalety w postaci prostoty, niższych kosztów i szerszego wyboru długości fal wzbudzenia.
Obrazowanie limfocytów T w nienaruszonym węźle chłonnym wymaga dożylnego wstrzyknięcia znakowanych limfocytów, które następnie migrują do organów limfatycznych. Jak wykazaliśmy wcześniej 1, metoda analizy na skrawkach (slice assay) jest w pełni kompatybilna z eksperymentami z transferem adoptywnym. Jednak czas potrzebny na migrację limfocytów T do węzłów chłonnych może utrudnić stosowanie barwników fluorescencyjnych, które mają tendencję do wyciekania z komórek wraz z upływem czasu. Dotyczy to przypadku barwnika Ca2+ fura-2. Dzięki szybkiej rekrutacji (< 30 min) limfocytów T do tkanki, analiza na skrawkach stwarza możliwość wykorzystania takich barwników. Wreszcie, metoda ta ma ogromną zaletę w postaci możliwości analizy funkcji limfocytów T w kilku utrzymanych przy życiu tkankach ludzkich.
Niniejszy system eksperymentalny posiada również ograniczenia, które należy wziąć pod uwagę. Uszkodzenia związane z krojeniem mogą wpływać na funkcjonowanie limfocytów T, zwłaszcza w obszarze powierzchownym tkanki, w pobliżu powierzchni cięcia. Aby ocenić śmierć komórek wewnątrz skrawka, zastosowano fluorescencyjny barwnik SYTOX green, który przenika do komórek z uszkodzoną błoną plazmatyczną. Nasze eksperymenty wykazały, że około 20% wszystkich komórek węzła, zlokalizowanych głównie w powierzchownym obszarze tkanki, zostało znakowanych tym barwnikiem jądrowym. Inną potencjalną kwestią w tym badaniu jest zdolność skrawków do zatrzymywania istotnych czynników rozpuszczalnych, w tym chemokin. Chociaż nie mamy przesłanek, aby dane zostały w ten sposób zaburzone, ponieważ limfocyty T wykazują dobrą ruchliwość wewnątrz skrawka, chcielibyśmy podkreślić znaczenie obrazowania limfocytów T w zdrowych obszarach położonych kilkadziesiąt mikronów od powierzchni cięcia. O ile można to wykonać za pomocą tradycyjnych mikroskopów (pola szerokiego lub konfokalnych), jak w niniejszym protokole, prawdopodobne jest, że przygotowanie skrawka węzła chłonnego w połączeniu z obrazowaniem dwufotonowym zwiększy rozdzielczość przestrzenną w głąb i zmniejszy fototoksyczność.
Oświadczenia
Nie zgłoszono konfliktów interesów.
Podziękowania
Autorzy chcieliby podziękować dr. Alainowi Trautmannowi, który zachęcił nas do wykonania przekrojów węzłów chłonnych. Praca ta była częściowo finansowana z grantów przyznanych przez Ligue Nationale Contre le Cancer, Fondation pour la Recherche Médicale en France oraz Association pour la recherche sur le Cancer.
Materiały
| Nazwa | Firma | Numer katalogowy | Komentarze |
|---|---|---|---|
| Mikroskop konfokalny | Leica Microsystems | SP5 | |
| Wibratom | Leica Microsystems | VT1200S | |
| Pęseta precyzyjna | World Precision Instruments, Inc. | 14142 | |
| Wkładki hodowlane 30 mm | EMD Millipore | PICM0RG50 | |
| RPMI | Invitrogen | 61870010 | Pełne medium RPMI przygotowuje się poprzez dodanie 10% inaktywowanej ciepłem płodowej surowicy cielęcej oraz penicyliny i streptomycyny. |
| Hanks’ Zrównoważony roztwór soli (HBSS) | Invitrogen | 14170088 | |
| Agaroza o niskiej temperaturze żelowania, typ VII-A | Sigma-Aldrich | A0701 | |
| Klej cyjanoakrylan butylu, Vetbond | 3M | 1469 | |
| Podkładki ze stali nierdzewnej, średnica wewnętrzna 4 mm | Dowolny dostawca | ||
| Cell Tracker green CMFDA | Invitrogen | C7025 |
Bibliografia
- Asperti-Boursin, F. CCR7 ligands control basal T cell motility within lymph node slices in a phosphoinositide 3-kinase-independent manner. J Exp Med. 204, 1167-1167 (2007).
- Bhakta, N. R., Oh, D. Y., Lewis, R. S. Calcium oscillations regulate thymocyte motility during positive selection in the three-dimensional thymic environment. Nat Immunol. 6, 143-143 (2005).
- Matheu, M. P., Cahalan, M. D. Isolation of CD4+ T cells from mouse lymph nodes using Miltenyi MACS purification. J Vis Exp. , (2007).
- Miller, M. J., Wei, S. H., Parker, I., Cahalan, M. D. Two-photon imaging of lymphocyte motility and antigen response in intact lymph node. Science. 296, 1869-1869 (2002).
- Ehrlich, L. I., Oh, D. Y., Weissman, I. L., Lewis, R. S. Differential contribution of chemotaxis and substrate restriction to segregation of immature and mature thymocytes. Immunity. 31, 986-986 (2009).
- Gollmer, K. CCL21 mediates CD4+ T-cell costimulation via a DOCK2/Rac-dependent pathway. Blood. 114, 580-580 (2009).
Przedruki i uprawnienia
