Mikroskopia TIRF do wizualizacji dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul

Streszczenie

Źródło: Henty-Ridilla, J.L., Wizualizacja dynamiki sprzężenia aktyny i mikrotubul in vitro za pomocą mikroskopii fluorescencji całkowitego wewnętrznego odbicia (TIRF). J. Vis. Exp. (2022)

Ten film opisuje TIRF, technikę opartą na mikroskopii wewnętrznego odbicia do wizualizacji dynamiki polimeryzacji aktyny i mikrotubul. Metoda ta umożliwia obrazowanie w wysokiej rozdzielczości dynamiki sprzęgania aktyny i mikrotubul w czasie rzeczywistym, co jest niezbędne do zrozumienia przesłuchów komórkowych.

Protokół

1. Mycie szkiełek nakrywkowych

UWAGA: Szkiełka nakrywkowe do prania (24 mm x 60 mm, #1.5) według Smith et al., 2013.

1. Ułóż szkiełka nakrywkowe w plastikowym pojemniku na pocztę pocztową.
2. Zanurz kolejno szkiełka nakrywkowe w następujących roztworach i poddaj sonikacji przez 30-60 minut, spłukując ddH₂O 10 razy pomiędzy każdym roztworem: ddH₂O jedną kroplą płynu do naczyń; 0,1 M KOH. Szkiełka nakrywkowe należy przechowywać w 100% etanolu przez okres do 6 miesięcy.
   nuta: Nie dotykaj powierzchni szklanych palcami bez rękawiczek. Zamiast tego użyj kleszczy.

2. Powłoka oczyszczona (24 mm x 60 mm, #1.5) szkiełka nakrywkowe z mPEG- i biotyny-PEG-silanu

UWAGA: Ten protokół wykorzystuje system biotyna-streptawidyna do pozycjonowania aktyny i mikrotubul w płaszczyźnie obrazowania TIRF. Można stosować inne powłoki i systemy (np. przeciwciała, poli-L-lizynę, miozynę NEM itp.).

1. Rozmrozić porcje proszków PEG-silan i biotyna-PEG-silan.
2. Rozpuść proszki PEG w 80% etanolu (pH 2,0), aby wytworzyć roztwory podstawowe powłoki 10 mg/ml mPEG-silanu i 2-4 mg/ml biotyny-PEG-silanu, tuż przed użyciem.
   nuta: Proszki PEG często wydają się rozpuszczone, ale mogą nie być na poziomie mikroskopowym. Prawidłowe wymieszanie trwa ~1-2 minuty przy ciągłym pipetowaniu. Zachęca się użytkowników do odpipetowania dodatkowych 10 razy po pojawieniu się rozpuszczenia proszku.
   ostrożność: Nosić rękawice, aby chronić skórę przed skoncentrowanym HCl podczas wytwarzania 80% etanolu (pH 2,0).
3. Usuń czyste (24 mm x 60 mm, #1.5) szkiełko nakrywkowe z magazynu etanolu za pomocą kleszczy. Osuszyć azotem gazowym i przechowywać na czystej szalce Petriego.
4. Szkiełka nakrywkowe pokryć 100 μl roztworu powlekającego: mieszaniną 2 mg/ml mPEG-silanu (MW 2 000) i 0,04 mg/ml biotyny-PEG-silanu (MW 3 400) w 80% etanolu (pH 2,0).
   nuta: Do rzadkiego powlekania (zalecane) należy użyć 2 mg/ml mPEG-silanu i 0,04 mg/ml biotyny-PEG-silanu. Do gęstego powlekania użyj 2 mg/ml mPEG-silanu, 4 mg/ml biotyny-PEG-silanu.
5. Szkiełka nakrywkowe inkubować w temperaturze 70 °C przez co najmniej 18 godzin lub do momentu użycia.
   nuta: Powlekane szkiełka nakrywkowe ulegają degradacji, jeśli są przechowywane w temperaturze 70 °C przez ponad 2 tygodnie.

3. Montaż komór przepływowych do obrazowania

1. Wytnij 12 pasków dwustronnej taśmy z podwójnym podkładem na długość 24 mm. Usuń jedną stronę podkładu taśmy i przymocuj kawałki taśmy przylegające do sześciu rowków znajdujących się w czystej komorze obrazowania.
   nuta: Taśma musi być płaska do prawidłowego montażu, w przeciwnym razie komory obrazowania będą przeciekać. Ostrożnie usuń podkład taśmy, aby uniknąć uderzeń. Zaleca się przesuwanie zaklejonych taśmą komór po czystej powierzchni w celu wygładzenia styków taśmy.
2. Usuń drugi kawałek podkładu taśmy, aby odsłonić lepką stronę taśmy wzdłuż każdego rowka komory. Umieść taśmę komory stroną do góry na czystej powierzchni.
3. Wymieszaj roztwory żywicy epoksydowej i utwardzacza w stosunku 1:1 (lub zgodnie z instrukcjami producenta) w małej łódce do ważenia.
4. Użyj końcówki P1000, aby umieścić kroplę zmieszanej żywicy epoksydowej między paskami taśmy na końcu każdego rowka komory obrazowania (czerwona strzałka; Rysunek 1A). Umieść taśmę komorową/stroną epoksydową do góry na czystej powierzchni.
5. Usunąć powlekane szkiełko nakrywkowe z inkubatora w temperaturze 70 °C. Pokryte i niepowlekane powierzchnie szkiełek nakrywkowych przepłukać sześciokrotnie ddH₂O, osuszyć przefiltrowanym gazowym azotem, a następnie przymocować do komory obrazowania stroną z powłoką szkiełka nakrywkowego w kierunku taśmy.
6. Użyj końcówki do pipety P200 lub P1000, aby wywrzeć nacisk na powierzchnię taśmy-szkło, aby zapewnić dobre uszczelnienie między taśmą a szkiełkiem nakrywkowym.
   nuta: Przy odpowiednim uszczelnieniu taśma dwustronna staje się półprzezroczysta. Komory obrazowania, w których brakuje wystarczających styków z komorą taśmy, będą przeciekać.
7. Zmontowane komory należy inkubować w temperaturze pokojowej przez co najmniej 5-10 minut, aby żywica epoksydowa mogła w pełni uszczelnić studzienki komory przed użyciem. Komory perfuzyjne tracą ważność w ciągu 12-18 godzin od montażu.
   nuta: W zależności od ułożenia taśmy i grubości zastosowanej taśmy dwustronnej, zmontowana komora będzie miała końcową objętość 20-50 μL.

4. Kondycjonowanie komór perfuzyjnych

1. Za pomocą pompy perfuzyjnej (szybkość ustawiona na 500 μl/min) sekwencyjnie wymieniać roztwory kondycjonujące w komorze perfuzyjnej w następujący sposób:
   1. Przepływ 50 μL 1% BSA w celu zalania komory obrazowania. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika złączki Luer-lock.
   2. Przepływ 50 μl 0,005 mg/ml streptawidyny. Inkubować przez 1-2 minuty w temperaturze pokojowej. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.
   3. Przelej 50 μl 1% BSA, aby zablokować niespecyficzne wiązanie. Inkubować przez 10-30 s. Usunąć nadmiar bufora ze zbiornika.
   4. Przepływ 50 μL ciepłej (37 °C) 1x bufor TIRF (1x BRB80, 50 mM KCl, 10 mM DTT, 40 mM glukozy, 0,25% (v/v) metyloceluloza (4,000 cp)).
      nuta: Nie usuwaj nadmiaru bufora ze zbiornika. Zapobiega to wysychaniu komory, co może wprowadzić pęcherzyki powietrza do systemu.
   5. Opcjonalnie: Przepływ 50 μL stabilizowanych i 50% biotynylowanych nasion mikrotubul rozcieńczonych w 1x buforze TIRF.
      nuta: Właściwe rozcieńczenie musi być określone empirycznie i zawierać zmienność między partiami. Rozcieńczenie dające 10-30 nasion na pole widzenia dobrze sprawdza się w tej konfiguracji.

5. Przygotowanie mikroskopu

UWAGA: Reakcje biochemiczne zawierające dynamiczne filamenty aktynowe i mikrotubule są wizualizowane/przeprowadzane za pomocą mikroskopu TIRF (Inverted Total Internal Reflection Fluorescence) wyposażonego w lasery na ciele stałym o mocy 120-150 mW, obiektyw TIRF z korekcją temperatury 63x i kamerę EMCCD. Białka w tym przykładzie są wizualizowane na następujących długościach fal: 488 nm (mikrotubule) i 647 nm (aktyna).

1. Ustaw stage/obiektywowe urządzenie grzewcze tak, aby utrzymywało temperaturę 35-37 °C co najmniej 30 minut przed obrazowaniem pierwszej reakcji biochemicznej.
2. Ustaw parametry akwizycji obrazu w następujący sposób:
   1. Ustaw interwał akwizycji co 5 s na 15-20 min.
   2. Ustaw ekspozycję lasera 488 i 647 na 50-100 ms przy mocy 5%-10%. Ustaw odpowiedni kąt TIRF dla mikroskopu.
      nuta: Niezależnie od konfiguracji mikroskopu, najprostszym sposobem ustawienia mocy lasera, ekspozycji i kąta TIRF jest dokonanie regulacji na obrazach dowolnego polimeru osobno (patrz 5.2.2.1 i 5.2.2.2 poniżej). Zdecydowanie zaleca się użytkownikom korzystanie z najniższych ustawień mocy lasera i ekspozycji, które nadal pozwalają na wykrycie.
      1. Dostosuj reakcję polimeryzacji (rysunek 1C), aby zainicjować składanie filamentu aktynowego i uzyskać obrazy przy długości fali 647 nm. Dokonaj odpowiednich korekt.
      2. Dostosuj reakcję polimeryzacji w drugiej kondycjonowanej studzience perfuzyjnej, aby zainicjować składanie mikrotubul (rysunek 1C) i uwidocznić przy 488 nm. Dokonaj odpowiednich korekt.

6. Przygotowanie mieszanin reakcji białkowych

1. Przygotować roztwór podstawowy tubuliny znakowanej fluorescencyjnie.
   1. Oznaczyć stężenie domowej roboty nieznakowanej tubuliny za pomocą spektrofotometrii przy Abs₂₈₀, w następujący sposób:
      1. Ślepy spektrofotometr z 1xBRB80 bez GTP.
      2. Obliczyć stężenie tubuliny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 115 000 M^‐1 cm^‐1 i następującego wzoru:
         
   2. Zawiesić komercyjnie wytwarzaną liofilizowaną 488-tubulinę znakowaną lizyną do 10 μM (1 mg / ml; 100% znacznik) z 20 μl 1x BRB80 bez GTP.
   3. Rozmrozić na lodzie 7,2 μl podwielokrotności 100 μM nieoznakowanej tubuliny pochodzącej z recyklingu.
      nuta: Tubulina z recyklingu ma kluczowe znaczenie dla udanego składania mikrotubul in vitro, ponieważ usuwa niekompetentne do polimeryzacji dimery powstałe w zamrożonych zapasach białkowych.
   4. Połączyć 3 μl 10 μM 488-tubuliny z 7,2 μl podwielokrotności 100 μM nieznakowanej tubuliny, nie później niż 15 minut przed użyciem.
2. Przygotować roztwór podstawowy znakowanej fluorescencyjnie aktyny.
   1. W przypadku białek domowej roboty należy określić stężenie i procentową etykietę aktyny za pomocą spektrofotometrii AbsAbs₂₉₀ i Abs₆₅₀ w następujący sposób:
      1. Ślepa próba spektrofotometru z buforem G.
      2. Obliczyć stężenie nieznakowanej aktyny, korzystając z wyznaczonego współczynnika ekstynkcji wynoszącego 25 974 M^‐1 cm^‐1 i następującego wzoru:
         
      3. Oblicz stężenie znakowanej lizyną Alexa-647-aktyny, korzystając ze współczynnika ekstynkcji nieznakowanej aktyny, współczynnika korekcji fluoru 0,03 i następującego wzoru:
         
      4. Oblicz procentową etykietę Alexa-647-aktyny, korzystając z wyznaczonej ε dla Alexa-647 wynoszącej 239 000 M^‐1 cm^‐1, w następujący sposób:
         
   2. Rozmrozić jedną 2 μl podwielokrotności 3 μM 100% znakowanej aktyny biotyny (oznaczonej na resztach lizyny). Rozcieńczyć 10-krotnie, dodając 18 μl buforu G.
   3. Połącz 3 μl rozcieńczonej biotynylowanej aktyny i odpowiednie objętości nieznakowanej i znakowanej aktyny (powyżej), tak aby końcowa mieszanina wynosiła 12,5 μM całkowitej aktyny z 10%-30% znacznikiem fluorescencyjnym.
      nuta: Powyżej 30% procent fluorescencyjnych monomerów aktyny (ostateczna) może pogorszyć rozdzielczość obrazowania, ponieważ włókna stają się trudne do odróżnienia od tła.
3. Przygotować mieszaniny reakcyjne (rysunek 1C).
   1. Przygotować mieszaninę cytoszkieletu (probówka A), łącząc 2 μl 12,5 μM mieszanki aktynowej (6.2.3) z mieszanką tubuliny (6.1.4), nie później niż 15 minut przed obrazowaniem. Przechowywać na lodzie do czasu użycia.
   2. Przygotuj białkową mieszankę reakcyjną (tuba B), łącząc wszystkie inne eksperymentalne składniki i białka, w tym 2x bufor TIRF, anty-wybielacz, nukleotydy, i białka pomocnicze. Przykład pokazano na rysunku 1C.
      nuta: W wyniku końcowego rozcieńczenia powstaje 1x bufor TIRF, który zawiera ATP, GTP i siłę jonową w szacowanym zakresie fizjologicznym.
4. Probówkę A i probówkę B inkubować oddzielnie w temperaturze 37 °C przez 30-60 s. Aby rozpocząć reakcję, wymieszaj i dodaj zawartość probówki B do probówki A (poniżej).

7. Obraz aktyny i dynamika mikrotubul

1. Dobrze kondycjonuj perfuzję (Rysunek 1B; krok 4, powyżej).
2. Zainicjuj jednocześnie składanie aktyny i mikrotubul, dodając zawartość probówki B (mieszanina reakcyjna) do probówki A (mieszanina cytoszkieletu) (ryc. 1C).
3. Przepłyń 50 μL reakcji zawierającej 1x bufor TIRF uzupełniony 15 μM wolną tubuliną, 1 mM GTP i 0,5 μM monomerami aktyny oraz odpowiednie objętości kontrolnych.
4. Nagrywaj filmy poklatkowe za pomocą oprogramowania mikroskopowego, aby rejestrować co 5 s przez 15-20 min.
   nuta: Inicjacja dynamiki aktyny i mikrotubul następuje w ciągu 2-5 minut (ryc. 2). Dłuższe opóźnienia wskazują na problemy z kontrolą temperatury lub problemy związane ze stężeniem białek w mieszaninie reakcyjnej.
5. Kondycjonuj nową studzienkę perfuzyjną (krok 4) i zastąp objętość buforu białkiem regulatorowym (białkami) regulatorowym (tj. Tau) i kontrolą buforu (Figura 1C). Zdobądź zgodnie z opisem w kroku 7 (powyżej), aby ocenić białka regulatorowe dla pojawiających się funkcji aktyno-mikrotubul
.

Wyniki

Rysunek 1. Schematy eksperymentalne: montaż komory przepływowej do akwizycji obrazu. (A) Zespół komory obrazowania. Od góry do dołu: komory obrazowania IBIDI są przyklejone taśmą wzdłuż studzienek perfuzyjnych (oznaczonych strzałką); druga (biała) warstwa podkładu taśmy (pozostawiona na obrazie pokazanym, aby lepiej zorientować użytkowników) jest usuwana, a żywica epoksydowa jest nakładana na krawędź komory perfuzy...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1% powierzchni ciała (w/v)	Fisher Naukowy	Zobacz materiał BP1600-100	W tym celu (komory blokujące TIRF) BSA jest ponownie zawieszany w ddH20 i filtrowany przez filtr 0,22 μm.
1× Zobacz materiał BRB80	domowej roboty		80 mM RURY, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 z KOH
80 mM RURY, 1 mM MgCl2, 1 mM EGTA, pH 6,8 z KOH	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	G2133-50KU	W połączeniu z katalazą, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 oC do czasu użycia
Tubulina 100 μM	Cytoskeleton Inc, Denver, Kolorado	Zobacz materiał T240	Tubuliny domowej roboty powinny być poddane recyklingowi przed użyciem w celu usunięcia tubuliny niekompetentnej do polimeryzacji (Hyman i in. (1992)29; Li i Moore (2020)30 ). Dostępne na rynku tubuliny są często zbyt rozcieńczone, aby można je było poddać recyklingowi, ale działają dobrze, jeśli są ponownie zawieszone zgodnie z instrukcjami producenta i wstępnie oczyszczone przez ultrawirowanie (278 000 × g) przez 60 minut przed użyciem.
100 mM ATP	Gold Biotechnology Inc, Olivette, Missouri	A-08	Ponownie zawieszony w ddH20 (pH 7,5) i wysterylizowany filtrem.
100 mM GTP	Fisher Naukowy	AC226250010	Ponownie zawieszony w 1× BRB80 (pH 6,8) i wysterylizowany filtrem.
Lasery na ciele stałym 120-150 mW	Mikrosystemy Leica	11889151; 11889148
2 mg/ml katalazy	Sigma Aldrich Inc, St. Louis, MO	Zobacz materiał C40-100	W połączeniu z oksydazą glukozową, podwielokrotność i przechowywać w temperaturze -80 oC do czasu użycia
2× Bufor TIRF	Domownik		2× BRB80, 100 mM KCl, 20 mM DTT, 80 mM glukozy, 0,5% (v/v) metylocelulozy (4,000 cp); Uwaga: 1 μl 0,1 M GTP i 1 μl 0,1 M ATP dodaje się oddzielnie do reakcji TIRF, aby uniknąć powtarzających się cykli zamrażania i rozmrażania.
24 × 60 mm, #1.5 szkło nakrywkowe	Fisher Scientific, Waltham, Massachusetts	22-266882	Szkło nakrywcowe należy dokładnie umyć przed użyciem (Smith i in. (2014)22 )
Blok grzewczy 37 oC
Łaźnia wodna o temperaturze 37 oC
5 mg/ml streptawidyny (600x w magazynie)	Avantor, Filadelfia, Pensylwania	Zobacz materiał RLS000-01	Zawieszony w Tris-HCl (pH 8,8); rozcieńczyć podwielokrotność do 1× w buforze HEK w dniu użycia
5 min Żywica epoksydowa i utwardzacz	Loctite, Skaliste Wzgórze, CT	1365736	Połączenie żywicy i utwardzacza może trwać do 30 minut.
50% biotynylowanych-GpCpp nasion mikrotubul	Cytoszkielet Inc.; Domowej roboty	T333P	(opcjonalnie) Nasiona mikrotubul stabilizowane GppCpp lub Taxol mogą bardziej efektywnie pośredniczyć w polimeryzacji mikrotubul. Taksol i GppCpp stabilizują mikrotubule na różne sposoby, które mogą wpływać na strukturę siatki mikrotubul i zdolność niektórych białek regulatorowych do wiązania się ze stabilizowaną częścią mikrotubul. Metoda wytwarzania różnych rodzajów nasion mikrotubul została opisana w Hyman et al. (1992).
Inkubator 70 C
Zapas mieszanki aktyny	Domowej roboty; ten protokół		Mieszanina aktyn 12,5 μM składająca się ze znakowanej (fluorescencyjnej i biotynylowanej) i nieznakowanej aktyny dla maksymalnie sześciu reakcji. W końcowej reakcji TIRF stosuje się 2 μl bulionu. Końcowe stężenie aktyny użytej w każdej reakcji wynosi 0,5 μM (10% Alexa-647; 0,09% znakowane biotyną).
Odpowiednie kontrolki bufora	domowej roboty		Kombinacja ze wszystkich ocenianych białek
Biotyna-PEG-silan (MW 3,400)	Laysan Bio Inc	biotyna-PEG-SIL-3400	Dozowane w porcjach 2-5 mg, wypełnione azotem, sparafilmowane zamknięte i przechowywane w temperaturze -20 C ze środkiem osuszającym do czasu użycia
Biotynylowana aktyna	Cytoszkielet Inc.; Domowej roboty	Zobacz materiał AB07	Biotyna-aktyna jest wytwarzana przez znakowanie na resztach lizyny, a zatem zakłada się, że jest co najmniej w 100% znakowana, ale różni się w zależności od różnych partii/preparatów. Optymalne stężenia biotynylowanych aktyn muszą być empirycznie określone dla poszczególnych zastosowań/projektów eksperymentalnych. Wyższe stężenia pozwalają na bardziej efektywne śledzenie, ale mogą utrudniać polimeryzację lub interakcje z białkami regulatorowymi. W tym przypadku niewielki procent (0,09% lub 900 pM) biotynylowanej aktyny jest obecny w końcowej reakcji TIRF.
Mydło do naczyń	Świt, Procter and Gamble, Cincinnati, OH		Z niewiadomych przyczyn wersja niebieska czyści szkiełka nakrywkowe skuteczniej niż inne dostępne kolory.
suchy lód
Aktyna znakowana fluorescencyjnie	Cytoszkielet Inc.; Domowej roboty	Biblioteka AR05	Domowa aktyna znakowana fluorescencyjnie jest przechowywana w buforze G uzupełnionym 50% glicerolem w temperaturze -20 C (Spudich i wsp. (1971) 47; Liu i in. (2022)48 ). Znakowana fluorescencyjnie aktyna jest dializowana z buforem G i wstępnie oczyszczana przez ultrawirowanie przez 60 minut w temperaturze 278 000 × g przed użyciem.
Tubulina znakowana fluorescencyjnie	Cytoszkielet Inc	TL488M, TLA590M, TL670M	Ponownie zawieszony w 20 μl 1× BRB80 (stężenie końcowe 10 μM) i wstępnie oczyszczony przez ultrawirowanie (278 000 × g) przez 60 minut przed użyciem.
Bufor G	domowej roboty		3 mM Tris-HCl (pH 8,0), 0,2 mM CaCl2, 0,5 mM DTT, 0,2 mM ATP
Bufor HEK	domowej roboty		20 mM HEPES (pH 7,5), 1 mM EDTA (pH 8,0), 50 mM KCl
lód
Wiaderko na lód
Komora obrazowania	IBIDI, Fitchburg, Wisconsin	Numer katalogowy: 80666	Zamów komory bez dna, aby wykorzystać różne powłoki szkieł nakrywkowych
Kamera iXon Life 897 EMCCD	Andor, Belfast, Irlandia Północna	8114137
Oprogramowanie mikroskopowe LASX Premium	Mikrosystemy Leica	8114137
Metyloceluloza (4,000 cp)	Sigma Aldrich Inc	Zobacz materiał M0512
Podstawa mikroskopu wyposażona w moduł TIRF	Leica Microsystems, Wetzlar, Niemcy	11889146
mPEG-silan (MW 2,000)