$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przeprowadzanie codziennych wyrównań LLSM
UWAGA: (Ważne) Ten protokół wyrównania jest oparty na używanym przyrządzie LLSM (zobacz Tabelę Materiałów). Każdy LLSM może być inny i wymagać różnych strategii dostosowania, zwłaszcza tych, które są budowane w domu. Przeprowadzić odpowiednie rutynowe wyrównanie i przejść do sekcji 2.
- Dodaj 10 ml wody plus 30 μl fluoresceiny (1 mg/ml bulwentu) do kąpieli LLSM (~10 ml objętości), naciśnij Obraz (Home), aby przesunąć obiektyw do pozycji obrazu i spójrz na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowadnic i wstępnie ustawionego obszaru zainteresowania (ROI), aby wiązka była cienkim wzorem zrównoważonym we wszystkich kierunkach.
- Wiązka powinna również wydawać się skupiona w aparacie szukacza. Do regulacji użyj dwóch regulatorów nachylenia lustra, górnego mikrometru, ostrości i kołnierza obiektywu emisyjnego. Patrz rysunek 1 A i B, aby zapoznać się z prawidłowo wyrównaną belką.
- Umyj wannę i obiektywy co najmniej 200 ml wody, aby całkowicie usunąć fluoresceinę.
- Standardowe kulki fluorescencyjne obrazu w mediach obrazowych (przygotowane przez przyklejenie kulek do szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm z poli-L-lizyną, patrz Tabela materiałów; można je wstępnie przygotować i ponownie wykorzystać) do funkcji fizycznego rozproszenia punktowego (PSF) w podłożach obrazowych.
UWAGA: W polu widzenia może być tylko jeden koralik do późniejszego przetworzenia, więc spróbuj znaleźć koralik, który jest sam w przeglądarce lub można go łatwo przyciąć, aby uzyskać pojedynczy koralik.
- Włącz roztrząsanie, ustawiając je na 3 w polu "Zakres X Galvo". Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżące pole. Przesuń się w kierunku Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i koraliki. Znajdź środek ściegu, przesuwając się wzdłuż Z, naciśnij Stop, aby zatrzymać laser. Zaznacz pole wyboru 3D, naciśnij przycisk Środek, a następnie naciśnij przycisk Execute (Wykonaj). Spowoduje to zebranie danych.
- Ręcznie wyreguluj lustro pochylone, kołnierz obiektywu i mikrometr ostrości, aby uzyskać najwyższe wartości szarości, a następnie wyreguluj w razie potrzeby, aby uzyskać odpowiednie wzorce dla trybów przechwytywania skanowania obiektywu, z galvo, z+obiektyw (totPSF) i skanowania próbki (samplePSF). Patrz rysunek 1 C-F dla prawidłowo wyregulowanych projekcji maksymalnej intensywności (MIP).
nuta: Różne tryby przechwytywania (skanowanie obiektywem, z galvo, z+obiektyw i skanowanie próbki) zmieniają sposób, w jaki arkusz świetlny porusza się po próbce. Do wyrównania należy używać wszystkich trybów skanowania.
- Przykładowy skan pokazuje, w jaki sposób dane będą zbierane podczas eksperymentu. Zbierz próbkę PSF, naciskając przycisk Execute (Wykonaj) w trybie skanowania próbki w celu prostowania i dekonwolucji. Zmień lasery na trzy tryby kolorów (488, 560, 647) i ponownie naciśnij Wykonaj.
nuta: Ponieważ obrazy LLSM są ustawione pod kątem (57,2°), obrazy przechwycone w trybie "skanowania próbki" są zbierane pod tym kątem, a zatem są "przekrzywione". Korekcja przekrzywienia to proces korekcji pod tym kątem i "ponownego wyrównania" obrazu do prawdziwego stosu z. Dane te muszą być zebrane na nośnikach obrazowania i we wszystkich kanałach, które będą obrazowane podczas eksperymentu. Jeśli nie zostanie to prawidłowo zebrane, dane nie zostaną prawidłowo skorygowane. Podobnie, upewnij się, że podłoże zostało podgrzane do 37 °C (lub żądanej temperatury eksperymentalnej).
2. Konfiguracja komórek za pomocą LLSM
- Dodać 100 000 komórek prezentujących antygen (APC) (50 μl) do okrągłego szkiełka nakrywkowego o średnicy 5 mm i pozostawić je na 10 minut.
- Nasmaruj uchwyt próbki, a następnie dodaj do niego szkiełko nakrywkowe komórką do góry. Dodaj kroplę podłoża do obrazowania na odwrocie szkiełka nakrywkowego, aby uniknąć pęcherzyków powietrza przed umieszczeniem go w kąpieli. Przykręć uchwyt próbki do piezo i naciśnij Obraz (Strona główna).
- Znajdź APC do obrazu, aby upewnić się, że LLSM i oprogramowanie do obrazowania (patrz Tabela materiałów) działają prawidłowo.
nuta: Obrazujemy w kroku co 0,4 μm z 60 krokami z i ekspozycją 10 ms dla dwóch kolorów z ditherem ustawionym na 3, co daje 1,54 s na klatkę obrazu 3D przy rozdzielczości XY ~200 nm i 400 nm Z. Ustawienia te mogą wymagać dostosowania w zależności od rozmiaru komórki, pożądanej rozdzielczości z i siły sygnału z zastosowanej techniki znakowania fluorescencyjnego. Zużycie energii lasera będzie się również różnić w zależności od zastosowanej techniki znakowania fluorescencyjnego.
- Naciśnij przycisk Na żywo, aby wyświetlić bieżący obraz. Przesuń wzdłuż Z, aby znaleźć szkiełko nakrywkowe i komórki.
- Znajdź środek transportera opancerzonego, przesuwając się w kierunku Z, a następnie naciśnij przycisk Stop, aby zatrzymać działanie lasera. Sprawdź 3D i wprowadź żądane ustawienia, naciśnij Środek, a następnie naciśnij Wykonaj. Spowoduje to zebranie danych.
- Obniż stolik do pozycji ładowania i dodaj 50 μl limfocytów T do pożywki obrazowej (100 000 komórek) kroplami bezpośrednio nad szkiełkiem nakrywkowym. Najlepiej pozwolić, aby kropla utworzyła się na końcu końcówki pipety, a następnie przyłożyć końcówkę do płynu do kąpieli. Podnieś scenę do tyłu, klikając "Obraz (Powrót)".
- Rozpocznij obrazowanie. Pamiętaj, aby ustawić żądany rozmiar stosu i długość filmu poklatkowego. Na przykład zobrazuj 60 stosów z krokiem co 0,4 μm i wprowadź 500 ramek czasowych. (Zazwyczaj) zatrzymaj nagrywanie przed osiągnięciem 500 klatek, aby uniknąć fotowybielania. Użyj trybu Na żywo, aby wyszukać pary komórek, a gdy zostaną wprowadzone gotowe i żądane ustawienia, naciśnij Wykonaj, aby zebrać dane. Zobacz rysunek 2, aby zapoznać się z przykładem.
