Mikroskopia świetlna w sieci do wizualizacji interakcji receptor-ligand w żywych komórkach

Streszczenie

Źródło: Rosenberg, J., et al. Wizualizacja czterowymiarowej dynamiki receptorów komórek T na powierzchni przy użyciu mikroskopii świetlnej kratowej. J. Vis. Exp. (2020).

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii świetlnej w kratach, aby zobrazować interakcje między żywymi limfocytami T a komórkami prezentującymi antygen. Metoda polega na skupieniu ultracienkiego arkusza światła sieciowego na oddziałującej parze komórek w celu uzyskania serii dwuwymiarowych obrazów, które są łączone w celu uzyskania czterowymiarowych obrazów o wysokiej rozdzielczości, które ujawniają czasoprzestrzenną dynamikę interakcji komórka-komórka.

Protokół

1. Przeprowadzanie codziennych wyrównań LLSM

UWAGA: (Ważne) Ten protokół wyrównania jest oparty na używanym przyrządzie LLSM (zobacz Tabelę Materiałów). Każdy LLSM może być inny i wymagać różnych strategii dostosowania, zwłaszcza tych, które są budowane w domu. Przeprowadzić odpowiednie rutynowe wyrównanie i przejść do sekcji 2.

1. Dodaj 10 ml wody plus 30 μl fluoresceiny (1 mg/ml bulwentu) do kąpieli LLSM (~10 ml objętości), naciśnij Obraz (Home), aby przesunąć obiektyw do pozycji obrazu i spójrz na pojedynczy wzór wiązki laserowej Bessela. Wyrównaj wiązkę laserową za pomocą prowa....

Wyniki

Rysunek 1: Wyrównanie LLSM. (A) Pożądany wzór wiązki dla eksperymentu obrazowania LLSM. (B) Zrzut ekranu przedstawiający proces wyrównywania wiązki; po lewej stronie znajduje się okienko ostrości pokazujące zwężoną, skupioną wiązkę; W prawym górnym rogu znajduje się wykres pokazujący, że belka jest wyśrodkowana w oknie; W prawym dolnym rogu znajduje się aparat szukacza, który równi.......

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szkiełka nakrywkowe okrągłe 5 mm	Światowe instrumenty precyzyjne	Numer katalogowy: 502040	Do obrazowania
Alexa Fluor 488 przeciwciało łańcuchowe TCR β przeciw myszemu łańcuchowi TCR	Legenda biologiczna	109215	Do obrazowania
Sól sodowa fluoresceiny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F6377	Do ustawiania ostrości pod mikroskopem
FluoSpheres Mikrosfery modyfikowane karboksylanem	Thermo Fisher Naukowy	F8810	Do ustawiania ostrości pod mikroskopem
Imaris	Płaszczyzna bitowa	N/a	Oprogramowanie śledzące; Inne opcje oprogramowania śledzącego to Amira lub Trackmate (Fidżi).
Mikroskop siatkowy z arkuszami świetlnymi	3i	N/a	Używany mikroskop
Leibovitz's L-15 Medium, bez czerwieni fenolowej	Thermo Fisher Naukowy	21083027	Do obrazowania
Książka slajdów	3i	N/a	Oprogramowanie do obrazowania LLSM
Poli-L-lizyna	Produkty badawcze Phenix	Zobacz materiał P8920-100ML	Do obrazowania

powiedział: powiedział: powiedział: