$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie preparatu mikroskopowego
UWAGA: Komórki U87 MG trzeciej do dziesiątej generacji o wysokiej aktywności są używane w eksperymentach SPT.
- Wysterylizuj szkiełka nakrywkowe o średnicy 22 mm × 22 mm już oczyszczone roztworem Piranha, zanurzając je w etanolu (99,9%).
- Za pomocą kleszczy wyjmij szkiełko nakrywkowe z roztworu etanolu (krok 1.1) i wysterylizuj, spalając etanol na płomieniu. Po spaleniu całego etanolu umieść szkiełka nakrywkowe w plastikowym naczyniu do hodowli komórkowych (35 x 10 mm) wypełnionym 2 ml pożywki komórkowej (bez czerwieni fenolowej).
- Dodać 50 μl zawiesiny komórek na szkiełko nakrywkowe i delikatnie popychać naczynie w przód i w tył, w lewo i w prawo, aby równomiernie rozprowadzić komórki. Umieść go w wilgotnej atmosferze.
- Gdy komórki U87 MG na szkiełku nakrywkowym osiągną konfluencję 20%–40% (~12 godzin), dodaj 20 μl CTAB-AuNRs (nanopręty złota syntetyzowane z cząsteczką bromku cetyltrimetyloamoniowego amonu jako środka ochronnego, 138 pM) do naczynia i rozproszyć. Inkubować w wilgotnej atmosferze przez 5 minut.
- Dodać 100 μl pożywki hodowlanej (bez czerwieni fenolowej) z naczynia opisanego w kroku 1.4 do rowka rowkowanego szkiełka podstawowego (rysunek 1), które jest wstępnie oczyszczone roztworem piranii.
- Wyjmij szkiełko nakrywkowe z naczynia i odwróć je na górze rowka szkiełka mikroskopowego (Rysunek 1). Uszczelnij go lakierem do paznokci, pozostaw do wyschnięcia i umieść na scenie, aby przeprowadzić eksperymenty SPT.
2. Przeprowadzanie eksperymentów ze śledzeniem pojedynczych cząstek za pomocą mikroskopii ciemnego pola (Rysunek 1).
- Umieść kroplę oleju na zanurzonym w oleju skraplaczu ciemnego pola (apertura numeryczna (NA) 1.43-1.20) i przekręć pokrętło, aby kondensator zetknął się ze szklanym szkiełkiem.
- Nałóż kroplę oleju na górną część szkła nakrywkowego i przekręć pokrętło ostrości, aby obiektyw zanurzający w oleju 60x (NA 0.7–1.25) dotknął oleju.
- Włącz źródło światła i lekko przekręć pokrętło ostrości, aby ustawić ostrość płaszczyzny obrazowania.
nuta: W polu widzenia tło jest czarne, komórki są jasne, a CTAB-AuNR (współczynnik proporcji ~ 2: 1, rysunek 2) są małymi kolorowymi (czerwonymi, żółtymi lub zielonymi) plamkami rozpraszającymi.
- Uchwyć próbkę rozpraszającą światło za pomocą kolorowej kamery CMOS. Kliknij "Ikona aparatu" w oprogramowaniu, aby nagrywać i eksportować format TIFF w celu zapisania obrazów.
3. Akwizycja danych
- Wyodrębnianie pojedynczej trajektorii długoterminowej
- Postępuj zgodnie z opisem na rysunku 3, aby przekonwertować obrazy ciemnego pola szeregów czasowych z trybu "kolor RGB" na tryb "8-bitowy". Na obrazie J kliknij pozycję Obraz | Rodzaj | 8 bitów. Aby dostosować kontrast, kliknij pozycję Obraz | Dostosuj | Jasność | Kontrast.
- Wybierz cząstkę docelową i odetnij tła szeregów czasowych, umieszczając je w ramce i usuwając za pomocą "Ctrl+X".
- Otwórz okno wykrywania cząstek i łączenia cząstek, klikając przycisk "Wtyczki | Klasyczny tracker cząstek | Śledzenie cząstek".
- Ustaw Promień na 6, Odcięcie na 0, a Percentyl na 0,01%.
nuta: Aby wykryć cząstkę, dostosuj powyższe trzy parametry za pomocą podglądu. Upewnij się, że promień jest nieco większy niż cząstka docelowa i mniejszy niż najmniejsza separacja między cząstkami. Percentyl to dolna granica rozkładu intensywności, która ma być cząstkami kandydującymi.
- Ustaw zakres połączenia na 5 i przemieszczenie na 10,
nuta: Aby połączyć cząstkę między kolejnymi sąsiednimi klatkami, dostosuj powyższe dwa parametry. Przemieszczenie to maksymalna liczba pikseli, o jaką cząstka może przesunąć się między dwiema kolejnymi klatkami, a Zakres połączeń to liczba kolejnych klatek, które należy wziąć pod uwagę przy określaniu najlepszego odpowiedniego dopasowania.
- Kliknij "OK", aby otworzyć okno wyników ParticleTracker i zobaczyć wyniki.
- Kliknij "Wizualizuj wszystkie trajektorie", aby sprawdzić wygenerowane trajektorie.
- Kliknij menu "Ponownie połącz cząstki" u góry, aby ponownie połączyć wykryte cząstki z różnymi zakresami połączeń i parametrami percentyla, jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie nie pasuje do poruszającej się trajektorii AuNR.
- Kliknij "Zapisz pełny raport", aby zapisać wyniki, jeśli trajektoria wygenerowana przez oprogramowanie i trajektoria ruchu AuNR są zgodne.
UWAGA: Przykład wyodrębniania pojedynczej trajektorii długoterminowej za pomocą obrazu J pokazano na rysunku 4.
