Interferencyjna mikroskopia refleksyjna do bezznacznikowej wizualizacji dynamiki mikrotubul

Abstract

Źródło: Mahamdeh, M., et al. Implementacja mikroskopii interferencyjnej do szybkiego obrazowania mikrotubul bez znaczników. J. Vis. Exp. (2019).

W tym filmie opisujemy technikę mikroskopii interferencyjnej (IRM) do wizualizacji mikrotubul rosnących na powierzchni szkiełka nakrywkowego w obecności odpowiedniego bufora. Po oświetleniu padającym światłem, interfejs szkiełko nakrywkowe-bufor i interfejs bufor-mikrotubula odbijają światło, które łączy się, tworząc wzór interferencyjny, umożliwiając wizualizację mikrotubul jako obrazów o wysokim kontraście na jasnym tle.

Protocol

1. Modyfikacja mikroskopu i soczewki obiektywu

1. Włóż lustro 50/50 do koła filtrów mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniej kostki filtrującej (Rysunek 1). Z lustrem 50/50 należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ często mają one powłokę antyrefleksyjną.
   nuta: Użyliśmy lustra 50/50 w pustej kostce filtracyjnej mikroskopu. Lustro 50/50 jest wkładane w miejsce, w którym znajduje się lustro dichroiczne.
2. Używaj obiektywu olejowego o dużym powiększeniu/dużej aperturze numerycznej (NA).
   nuta: W tym protokole użyliśmy obiektywu 100x/1,3 NA.

Results

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie usługi IRM. (A) Epi-oświetlenie ze źródła światła przechodzi przez przysłonę apertury przed dotarciem do lustra 50/50. Przysłona aperturowa ustawia szerokość wiązki, a tym samym oświetlenie NA. Lustro 50/50 częściowo odbija światło aż do obiektywu, aby oświetlić próbkę. Światło odbite od próbki jest zbierane, a następnie rzutowane na chip kamery (przez soczewkę tubusu), gdzie zakłóca generowan.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mikroskop	Nikon	Ti-Zaćmienie	Odwrócony mikroskop używany do wykonywania eksprimingów
Rozdzielacz wiązki 50/50	Chroma	21000	Przy zakupie upewnij się, że wybierasz wymiary rozdzielacza, które pasują do kostki używanej w mikroskopie
Obiektyw NIKON PLAN FLUOR 100X/0.5-1.3 Iris	Nikon	MRH02902	Obiektyw do obrazowania. Ten obiektyw ma przysłonę korygującą NA, która została otwarta na NA 1.3
Uniwersalny detergent Mucasol	Sigma-Aldrich	Z637181-2L	Służy do czyszczenia szkiełek nakrywkowych i szkiełek
Folia parafinowa z tworzywa sztucznego (nazwa handlowa Parafilm M)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P7793	Służy do budowy kanałów przepływowych
Przeciwciało anty-TAMRA	Invitrogen	A-6397	Służy do wiązania cząsteczek znakowanych TAMRA (np. mikrotubul) z powierzchnią próbki. RYD (AB_2536196)
Poloxamer 407 (nazwa handlowa Pluronic F-127)	Sigma-Aldrich		Służy do blokowania powierzchni kanału, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu
Nanocząstki złota 40 nm	Sigma-Aldrich	753637	Używany jako próbka kontrolna
Nanocząstki złota o długości fali 20 nm	Sigma-Aldrich	Numer telefonu 753610	Używany jako próbka kontrolna
Aparat fotograficzny Zyla 4.2	Andor	Żyła 4.2	2048x2048 pixles (rozmiar piksela 6,5 μm) z wydajnością kwantową 72% i 16-bitowym zakresem dynamicznym
Oprogramowanie śledzące Feista			https://www.bcube-dresden.de/ fiesta/wiki/FIESTA
Mikrotubule stabilizowane			Przygotowane we własnym zakresie (patrz referencje w tekście)