$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Modyfikacja mikroskopu i soczewki obiektywu
- Włóż lustro 50/50 do koła filtrów mikroskopu fluorescencyjnego za pomocą odpowiedniej kostki filtrującej (Rysunek 1). Z lustrem 50/50 należy obchodzić się ostrożnie, ponieważ często mają one powłokę antyrefleksyjną.
nuta: Użyliśmy lustra 50/50 w pustej kostce filtracyjnej mikroskopu. Lustro 50/50 jest wkładane w miejsce, w którym znajduje się lustro dichroiczne.
- Używaj obiektywu olejowego o dużym powiększeniu/dużej aperturze numerycznej (NA).
nuta: W tym protokole użyliśmy obiektywu 100x/1,3 NA.
2. Przygotowanie komory do przylegania mikrotubul do powierzchni
- Wyczyść szkiełka mikroskopowe i szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm (do mikroskopu pionowego) lub szkiełka nakrywkowe 22 mm x 22 mm i 18 mm x 18 mm (do mikroskopów odwróconych). W razie potrzeby zmodyfikuj powierzchnię. Na przykład wyczyść szkiełka nakrywkowe za pomocą alkalicznego detergentu (patrz tabela materiałów), a następnie 100% etanolu z wodą destylowaną, przemyj je pomiędzy i po.
- Wytnij paski plastikowej folii parafinowej o szerokości 3 mm (patrz tabela materiałów) za pomocą żyletki i innego szkiełka mikroskopowego jako krawędzi.
- Umieść dwa plastikowe paski folii parafinowej w odległości 3 mm od siebie na czystym szkiełku nakrywkowym o wymiarach 22 x 22 mm. Następnie umieść szkiełko nakrywkowe o wymiarach 18 mm x 18 mm, aby utworzyć kanał. Jeśli używasz mikroskopu pionowego, umieść paski na czystym szkiełku mikroskopowym, a następnie umieść szkiełko nakrywkowe na górze.
- Umieść szkiełko nakrywkowe (lub szkiełko) na bloku grzewczym w temperaturze 100 °C na 10-30 sekund, aby folia parafinowa utworzyła szczelny kanał.
- Przelać 50 μg/ml przeciwciała (w Brinkley Buffer 1980 (BRB80)) przez perfuzję za pomocą pipety. Inkubować przez 10 min.
nuta: Używamy przeciwciał anty-rodaminowych do wiązania nasion mikrotubul znakowanych rodaminą z powierzchnią. Alternatywnie, awidyna może być stosowana do wiązania nasion mikrotubul znakowanych biotyną lub do biotynylowanych cząstek złota. Aby po prostu przyjrzeć się mikrotubulom przy braku tubuliny w roztworze (tj. Test niedynamiczny), można użyć przeciwciała antytubulinowego.
- Umyć pięć razy buforem BRB80. Zaleca się filtrowanie roztworów za pomocą filtra 0,22 μm.
- Przepływ w 1% poloksamerze 407 (kopolimer triblokowy) w BRB80 w celu zablokowania powierzchni przed niespecyficznym wiązaniem. Inkubować przez 10 minut.
- Umyć pięć razy buforem BRB80.
- Próbka jest gotowa do umieszczenia w mikroskopie. Aby zapobiec wysychaniu próbki, dodaj dwie kropelki buforu BRB80 na końcach kanału i uzupełnij w razie potrzeby.
3. Wyrównanie mikroskopu
- Umieść próbkę na stoliku mikroskopu. Włącz źródło światła epi-illumination.
- Skoncentruj się na powierzchni próbki. Będziesz obserwować wiele powierzchni, gdy obiektyw jest przesuwany w górę iw dół z powodu wstecznego odbicia światła od optyki w obrębie ścieżki optycznej. Dobrą metodą znalezienia powierzchni próbki jest skupienie się na krawędzi filmu parafinowego. Po znalezieniu powierzchni ustaw pole widzenia na środku komory.
- Wyśrodkuj przysłonę polową w polu view, zamykając ją do połowy i używając regulacyjnych. Po wyrównaniu ponownie otwórz membranę.
nuta: Regulacja musi być wykonywana tylko sporadycznie, być może co 3-6 miesięcy lub podczas rozwiązywania problemów.
- Wsuń soczewkę Bertranda, aby view źrenica wyjściowa (tylna płaszczyzna ogniskowa) obiektywu.
- Zamknij przysłonę przysłony (AD) poza krawędziami źrenicy wyjściowej obiektywu.
- Użyj regulacyjnych, aby wyśrodkować AD ze źrenicą wyjściową. Sprawdź dokładnie, otwierając AD i dopasowując jego krawędzie do krawędzi źrenicy wyjściowej.
nuta: Ta regulacja musi być wykonywana tylko sporadycznie.
- Ustaw przysłonę przysłony na około 2/3 NA obiektywu.
4. Obrazowanie stabilizowanych mikrotubul lub cząstek złota o długości 40 nm
UWAGA: Stabilizowane mikrotubule i nanocząstki złota służą jako dobre próbki kontrolne. Zaleca się obrazowanie mikrotubul lub nanocząstek złota przymocowanych do powierzchni jako pierwszego kroku do oceny wydajności IRM i pomocy w ustawieniu optymalnego otwarcia membrany apertury (sekcja 7).
- Ustaw czas naświetlania aparatu na 10 ms i dostosuj oświetlenie, aby prawie nasycić zakres dynamiczny kamery.
- Przepłynąć 10 μl mikrotubul stabilizowanych difosfonianem guanylilu (alfa, beta)-metyleno-difosfonianem (GMPCCP) lub taksolem w BRB80 (lub cząstkach złota o długości 40 nm) przez perfuzję za pomocą pipety do świeżej próbki i monitorować wiązanie poprzez obrazowanie powierzchni. Gdy 10-20 mikrotubul znajdzie się w polu widzenia, przemyj próbkę 2x za pomocą BRB80.
nuta: Przy dobrze ustawionym mikroskopie mikrotubule powinny być widoczne bez odejmowania tła.
- Zrób 10 zdjęć, ustawiając film poklatkowy z 1-sekundowym opóźnieniem na 10 sekund (przy ekspozycji 10 ms).
- Uzyskaj obraz tła. Aby to zrobić, przesuń stolik za pomocą kontrolera sceny lub oprogramowania komputerowego wzdłuż osi kanału, rejestrując 100 obrazów bez opóźnienia (tj. przesyłanie strumieniowe bliskie 100 kl./s @ 10 ms ekspozycji).
nuta: Tło to mediana ze 100 obrazów. Biorąc pod uwagę medianę, profil oświetlenia i inne nieruchome elementy, takie jak brud na optyce, są zachowywane, podczas gdy wszystko inne jest odfiltrowywane. Próbka nie powinna być przechylona, ponieważ doprowadzi to do zmiany położenia osiowego podczas przesuwania stolika i ostatecznie pogorszy jakość obrazu tła. Jeśli nie można uniknąć nachylenia, alternatywną metodą jest uzyskanie uśrednionych obrazów tła przed wylaniem nasion.
- Aby przetworzyć i przeanalizować obrazy, przejdź do kroku 6.
5. Obrazowanie dynamiki mikrotubul
- W przypadku dynamiki mikrotubul z wykorzystaniem tubuliny mózgowej należy ustawić temperaturę podgrzewacza próbki na 37 °C.
- Przepłynąć 10 μl nasion mikrotubul stabilizowanych GMPCCP w BRB80 przez perfuzję za pomocą pipety do świeżej próbki i monitorować ich wiązanie z powierzchnią poprzez obrazowanie powierzchni na żywo (tj. podczas strumieniowania). Gdy 10-20 nasion zostanie związanych z polem widzenia, umyj próbkę za pomocą 2x objętości kanałowej z BRB80 (BRB80 należy wstępnie podgrzać do 37 °C lub co najmniej w temperaturze pokojowej).
nuta: Przy dobrze ustawionym mikroskopie nasiona powinny być widoczne bez odejmowania tła.
- Przepływ w mieszaninie polimeryzacyjnej (7,5 μM nieznakowanej tubuliny + 1 mM trifosforanu guanozyny (GTP) + 1 mM ditiotreitolu (DTT) w buforze BRB80). Aby zmierzyć wzrost mikrotubul, ustaw film poklatkowy za pomocą oprogramowania do akwizycji, aby uzyskać obraz co 5 sekund (0,2 klatki na sekundę (fps)) przez 15 minut.
- Aby zwiększyć kontrast, uzyskaj 10 obrazów (zamiast jednego) w każdym punkcie czasowym i uśrednij je. W przypadku skurczu mikrotubul należy uzyskać obrazy z prędkością 100 kl./s, ustawiając opóźnienie czasowe na 0 i czas ekspozycji 10 ms (możliwa jest wyższa liczba klatek na sekundę przy mniejszych obszarach zainteresowania w zależności od używanej kamery).
- Uzyskaj obraz tła jak w kroku 4.4.
6. Przetwarzanie i analiza obrazu
UWAGA: Do analizy, ten protokół używa Fidżi, ale czytelnik może swobodnie korzystać z dowolnego oprogramowania, które uzna za odpowiednie.
- Otwórz zapisane obrazy tła.
- Oblicz medianę obrazu (tj. tła) za pomocą projektu Obraz > Stos > Z > Mediana.
- Otwórz film o dynamice mikrotubul jako stos (tak samo jak w przypadku mikrotubul niedynamicznych) za pomocą polecenia File > Open.
- Odejmij obraz tła od stosu za pomocą kalkulatora Process > Image. Upewnij się, że zaznaczyłeś opcję "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)".
- W przypadku mikrotubul dynamicznych za pomocą narzędzia do tworzenia linii narysuj linię wzdłuż interesującej nas mikrotubuli i dodaj ją do menedżera obszaru zainteresowania, naciskając "t". Powtórz tę czynność dla wszystkich interesujących nas mikrotubul.
- W przypadku dynamicznych mikrotubul uruchom makro Multi-Kymo. Makro wygeneruje wideo i kimograf dla każdej mikrotubuli w menedżerze ROI. Każda mikrotubula otrzyma unikalny identyfikator.
- W przypadku dynamicznych mikrotubul uruchom makro Kymo-Analysis i postępuj zgodnie z jego krokami, aby zmierzyć tempo wzrostu i kurczenie się mikrotubul.
7. Rozmiar przysłony
UWAGA: Ważnym czynnikiem dla uzyskania obrazów mikrotubul o wysokim kontraście za pomocą IRM jest prawidłowe ustawienie apertury numerycznej oświetlenia (INA). INA można zmienić, zmieniając rozmiar docierającej wiązki oświetlenia do źrenicy wyjściowej obiektywu, która jest kontrolowana przez rozmiar AD (AD znajduje się w płaszczyźnie sprzężonej ze źrenicą wyjściową (tylna płaszczyzna ogniskowa) obiektywu, rysunek 1):
gdzie DAD to średnica przysłony, fobiektyw to ogniskowa obiektywu, a Dep to średnica źrenicy wyjściowej obiektywu. Zazwyczaj AD pozostaje całkowicie otwarty do obrazowania fluorescencyjnego, więc INA jest równa NA, które jest równe NA. W mikroskopie fluorescencyjnym skala AD nie wskazuje jego średnicy, dlatego nie można obliczyć INA. Możliwe jest skalibrowanie rozmiaru AD za pomocą obiektywu. Nie jest to jednak konieczne, ponieważ rozmiar AD byłby ustalony na rozmiar, który daje najwyższy kontrast.
- Przygotować próbkę stabilizowanych mikrotubul znakowanych fluorescencyjnie przyklejonych do powierzchni (kroki 4.1-4.2).
nuta: Użyliśmy mikrotubul znakowanych tetrametylorodaminą (np. 550 nm, Em: 580 nm).
- Ustaw ostrość mikrotubul za pomocą pokrętła ostrości mikroskopu, jednocześnie obrazując je fluorescencyjnie (jeśli mikrotubule nie są oznaczone, zobrazuj je za pomocą IRM lub DIC).
- Ustaw ekspozycję aparatu na 10 ms za pomocą oprogramowania aparatu.
nuta: Ta ekspozycja jest arbitralna i ekspozycja 100 ms również by się sprawdziła.
- Zamknij AD do najmniejszego otworu. Dostosuj oświetlenie, aby prawie nasycić zakres dynamiczny kamery lub osiągnąć maksimum możliwości.
nuta: Jako wskazówkę należy skorzystać z tabeli przeglądowej zwykle dostarczanej przez oprogramowanie do pozyskiwania.
- Uzyskaj 10 obrazów (przesyłając strumieniowo lub robiąc zdjęcie co sekundę) pola widzenia zawierającego 10+ mikrotubul.
- Uzyskaj obraz tła jak w kroku 4.4.
- Zmień rozmiar AD i powtórz kroki 7.5-7.6 dla całego zakresu otwarcia AD (od wielkości źrenicy zamkniętej do wyjściowej, Rysunek 2). Za każdym razem, gdy rozmiar AD jest zmieniany, dostosuj intensywność oświetlenia do tej z kroku 7.4.
- Dla każdego uzyskanego pola widzenia odejmij odpowiednie tło za pomocą kalkulatora obrazu > procesu i wybierając "odejmij" z menu rozwijanego. Upewnij się, że opcja "Wynik 32-bitowy (zmiennoprzecinkowy)" jest zaznaczona. Następnie uśrednij wynikowe obrazy za pomocą obrazu > stosu > projektu Z> średni.
- Zmierzyć stosunek sygnału do szumu tła (SBR) mikrotubul zdefiniowany jako średnie natężenie sygnału mikrotubuli (intensywność mikrotubuli minus intensywność tła) podzielone przez odchylenie standardowe tła (rysunek 3).
- Określ optymalny rozmiar AD (tj. optymalny INA), obliczając średni SBR mikrotubul dla każdego rozmiaru otworu i ustaw rozmiar AD na ten, który daje najwyższy SBR (rysunek 2). Możliwe, że istnieje szereg rozmiarów AD, które dają porównywalny kontrast.
