Statyczna mikroskopia sił atomowych w celu wizualizacji i scharakteryzowania złożonych nukleosomów

Streszczenie

Źródło: Stormberg, T., et al. Sondowanie struktury i dynamiki nukleosomów za pomocą obrazowania pod mikroskopią sił atomowych. J. Vis. Exp.(2019 rok)

W tym filmie demonstrujemy statyczną mikroskopię sił atomowych, aby zobrazować złożone nukleosomy. Ta technika obrazowania o wysokiej rozdzielczości pozwala na badanie struktury nukleosomów.

Protokół

1. Funkcjonalizacja powierzchni miki do statycznego obrazowania AFM nukleosomów

1. Przygotować 50 mM roztwór podstawowy 1-(3-aminopropylo)silatranu APS w wodzie dejonizowanej, jak opisano. Przechowywać 1 ml porcji tego roztworu w temperaturze 4 °C do momentu użycia.
   nuta: Podwielokrotności mogą być przechowywane przez ponad rok w temperaturze 4 °C.
2. Przygotować działający roztwór APS 1:300 do modyfikacji miki, rozpuszczając 50 μl 50 mM materiału APS w 15 ml dd H₂O.
   nuta: Ten roztwór roboczy można przechowywać w temperaturze pokojowej przez kilka dni.
3. Wytnij 1 x 3 cm paski miki z wysokiej jakości arkuszy miki (patrz Tabela materiałów dla używanej miki tutaj).
   1. Sprawdź, czy element pasuje po umieszczeniu po przekątnej w kuwecie. Użyj końcówki ostrej pęsety, żyletki lub taśmy klejącej, aby rozciąć warstwy miki, aż obie strony zostaną świeżo rozcięte, a kawałek będzie tak cienki, jak ~0,1 mm (Rysunek 1A). Natychmiast umieść kawałek miki w kuwecie wypełnionej APS i inkubuj przez 30 minut (Rysunek 1B).
4. Przenieś kawałek miki do kuwety wypełnionej dd H2O i moczyć przez 30 sekund (Rysunek 1C). Całkowicie wysuszyć obie strony paska APS-mika pod strumieniem argonu.
   nuta: Chusteczka z włókniny celulozowo-poliestrowej do pomieszczeń czystych (zalecana chusteczka szczegółowo opisana w materiałach) może być użyta do odprowadzania wody z krawędzi miki podczas suszenia.
5. Użyj teraz paska suchej miki do przygotowania próbki. W przeciwnym razie przechowuj element w czystej, suchej kuwecie (Rysunek 1D).
   nuta: Dodatkowe przechowywanie w próżni przez 1-2 godziny jest zalecane, gdy środowisko jest wilgotne. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Przygotowanie próbek nukleosomów na APS-Mica do statycznego obrazowania AFM

1. Nałóż dwustronną taśmę klejącą na kilka krążków magnetycznych i umieść je z boku.
2. Przytnij podłoże z miki APS do żądanego rozmiaru (kwadraty 1 x 1 cm dla zastosowanego tutaj instrumentu MM AFM). Umieść te kawałki na czystej szalce Petriego i trzymaj je pod przykryciem.
3. Przygotować trzy rozcieńczenia połączonych nukleosomów (końcowe stężenia nukleosomów 0,5, 1,0 i 2,0 nM) przy użyciu przefiltrowanego buforu 0,22 μm zawierającego 10 mM HEPES pH 7,5 i 4 mM MgCl₂,
   nuta: Aby ograniczyć utratę nukleosomów przy niskim stężeniu końcowym, rozcieńczenia należy wykonywać pojedynczo, bezpośrednio przed osadzaniem na APS-mice.
4. Umieść 5-10 μl rozcieńczonej próbki nukleosomu w środku kawałka APS-miki i pozwól jej inkubować przez dwie minuty. Delikatnie przepłukać próbkę 2-3 ml dd_H2O, aby usunąć wszystkie składniki buforu. Po każdym użyciu ~0,5 ml dd_H2Odelikatnie potrząśnij miką, aby usunąć nadmiar wody do płukania.
   nuta: Do tego etapu płukania zalecana jest jednorazowa strzykawka.
5. Osuszyć osadzoną próbkę pod lekkim strumieniem czystego argonu gazowego.
   nuta: Próbka jest teraz gotowa do obrazowania lub może być przechowywana w komorze próżniowej lub eksykatorze wypełnionym argonem. Próbki przygotowane i przechowywane zgodnie z opisem zostały zobrazowane po upływie jednego roku od przygotowania bez utraty jakości. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

3. Statyczne obrazowanie nukleosomów AFM

1. Zamontuj końcówkę AFM na uchwycie końcówki. Użyj końcówki, która ma stałą sprężystości ~40 N/m i częstotliwość rezonansową od 300 do 340 kHz (patrz Tabela materiałów dla zastosowanych wsporników tutaj).
2. Zamontuj próbkę przygotowaną w sekcji 3 na stoliku AFM, uważając, aby nie zetknąć się z powierzchnią próbki.
3. Ustaw laser nad wspornikiem, aż suma osiągnie maksimum i dostosuj wartości odchylenia pionowego i bocznego do wartości bliskich zeru.
4. Dostrój sondę AFM, aby znaleźć jej częstotliwość rezonansową i wyreguluj amplitudę napędu oraz ustaw rozmiar obrazu na 100 x 100 nm. Kliknij przycisk włączenia, aby rozpocząć podejście.
5. Po zbliżeniu się stopniowo optymalizuj nastawę amplitudy, aż powierzchnia próbki będzie wyraźnie widoczna. Zwiększ rozmiar skanu do 1 x 1 μm, a rozdzielczość do 512 x 512 pikseli. Kliknij przycisk przechwytywania, a następnie przycisk włączenia, aby rozpocząć pobieranie obrazu.
   nuta: Obrazy na rysunku 2 pokazują gładkie tło, którego można się spodziewać podczas obrazowania tych próbek.

Wyniki

Rysunek 1: Schemat procesu przygotowania miki funkcjonalizowanej APS do obrazowania AFM nukleosomów. (A) kawałek miki o grubości ~0,1 mm ma obie strony świeżo rozszczepione. (B) Rozdrobniony kawałek miki jest natychmiast umieszczany po przekątnej w kuwecie zawierającej roztwór APS i ustawiany na inkubację przez 30 minut. (C) Po etapie funkcjonalizacji APS, kawałek miki APS przenosi się do kuwety wypełnionej dd H2O ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CENP-A/H4)2, rekombinowany ludzki	EpiCypher, Durham, Karolina Północna	Numer katalogowy: 16-0010	Numer katalogowy dla 50 ug
H2A/H2B, rekombinowany człowiek	EpiCypher, Durham, Karolina Północna	Numer katalogowy: 15-0311	Numer katalogowy dla 50 ug
Oktamer H3, rekombinowany człowiek	EpiCypher, Durham, Karolina Północna	16-0001	Numer katalogowy dla 50 ug
Zestaw urządzeń do dializy Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.1 mL	ThermoFischer Scientific, Waltham, Massachusetts	Numer katalogowy: 69574	Numer katalogowy dla 10 urządzeń
chlorek sodu	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	S9888-500G	Numer katalogowy dla 500 mg
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-0,5 ml	Millipore-sigma, Burlington, Missouri	UFC501008	Numer katalogowy dla 8 urządzeń
Hcl	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	258148-25ML	Numer katalogowy dla 25 ml
Trykot	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	T0377-25G	Numer katalogowy dla 25 g
Sds	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	11667289001	Numer katalogowy dla 1 kg
Nadsiarczan amonu (AmmPS)	Bio-Rad, Herkules, Kalifornia	Numer katalogowy: 1610700	Numer katalogowy dla 10 g
30% roztwór akryloamidu/bis, 37,5:1	Bio-Rad, Herkules, Kalifornia	1610158	Numer katalogowy dla 500 ml
TEMED	Bio-Rad, Herkules, Kalifornia	Numer katalogowy: 1610800	Numer katalogowy dla 5 ml
4x bufor do próbek białka Laemmli dla SDS-PAGE	Bio-Rad, Herkules, Kalifornia	1610747	Numer katalogowy dla 10 ml
2-ME	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	Zobacz materiał M6250-10ML	Numer katalogowy dla 10 ml
ageRuler Prestained Protein Ladder (Drabinka z prebarwionym białkiem	ThermoFischer Scientific, Waltham, Massachusetts	Numer katalogowy: 26616	Numer katalogowy dla 500 uL
Bio-bezpieczna™ bejca Coomassie	Bio-Rad, Herkules, Kalifornia	1610786	Numer katalogowy dla 1 L
Chusteczki z włókniny do pomieszczeń czystych: TX604 TechniCloth	TexWipe, Kernersvile, Karolina Północna	Zobacz materiał TX604
Mika moskiewska blokowa	AshevilleMica, Newport News, Wirginia	Stopień-1
HEPESY	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	H4034-25G	Numer katalogowy dla 25 g
Taśma klejąca	Scotch-3M, St. Paul, MN
Sonda TESPA-V2 afm (do obrazowania statycznego)	Sondy AFM firmy Bruker, Camarillo, Kalifornia
Filtr Millex-GP, 0,22 μm	Sigma-Aldrich, St. Louis, MO	SLGP05010	Numer katalogowy dla 10 urządzeń
Sonda BL-AC10DS-A2 afm (do HS-AFM)	Olympus, Japonia
Wielomodowy mikroskop sił atomowych	Bruker-Nano/Veeco, Santa Barbara, Kalifornia

)