Artykuł metodologiczny

Szybka poklatkowa mikroskopia sił atomowych w celu uchwycenia dynamiki nukleosomów

8 lipca 2025

W tym artykule

Streszczenie

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Źródło: Stumme-Diers, M. P., et al., Probing The Structure And Dynamics Of Nucleosomes Using Atomic Force Microscopy Imaging.J. Vis. Exp.(2019 rok)

W tym filmie demonstrujemy szybką mikroskopię sił atomowych w czasie poklatkowym, AFM, techniki obrazowania do badania dynamiki kompleksów nukleosomów. Gdy końcówka AFM skanuje powierzchnię nukleosomu, wykrywa zmiany wysokości nukleosomu i rejestruje rozwijanie się DNA w czasie.

Protokół

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Ciągłe rozcieńczanie mononukleosomów

  1. Wygeneruj i oczyść substrat DNA o długości około 400 pz, który zawiera niecentryczną sekwencję pozycjonowania nukleosomów Widom 601.
    nuta: Aby ograniczyć niepożądane tworzenie się dinukleosomów, każde "ramię" flankujące sekwencję pozycjonującą nie powinno przekraczać ~150 pz.
    1. Użyj plazmidu pGEM3Z-601 wraz z zaprojektowanymi starterami i amplifikuj DNA substratu za pomocą PCR. W przypadku stosowanego tutaj podłoża 423 pz o długościach ramion 122 i 154 pz należy użyć starterów do przodu (5'-CAGTGAATTAATACGACTC-3') i do tyłu (5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3').
    2. Dodać probówki zawierające mieszaninę reakcyjną do termocyklera podgrzanego do temperatury 95 °C. Uruchomić następujący program przez 33 cykle po wstępnej denaturacji przez 5 minut w temperaturze 95 °C: 30 s denaturacji w temperaturze 95 °C, 30 s wyżarzania w temperaturze 49 °C i 35 s przedłużenia w temperaturze 72 °C. Ustawić końcowe przedłużenie w temperaturze 72 °C na 10 minut po upływie 33 cykli.
    3. Oczyść DNA z mieszaniny PCR za pomocą dostępnego w handlu zestawu do oczyszczania PCR. Podczas elucji DNA z kolumny oczyszczającej PCR należy użyć 10 mM buforu Tris (pH 7,5) zamiast dostarczonego zestawu buforu elucyjnego.
      nuta: Zachowaj szczególną ostrożność, aby nie przenosić między etapami oczyszczania. Zanieczyszczony eluent może powodować problemy podczas pomiaru stężenia DNA i/lub może zmieniać początkowe stężenie soli w mieszaninie zespołu nukleosomów.
  2. Oznaczyć stężenie DNA, mierząc absorbancję oczyszczonego DNA przy długości fali 260 nm.
    1. Pobrać ślepą próbę na spektrofotometrze UV VIS, używając tylko buforu elucyjnego 10 mM Tris pH 7,5. Pobrać pomiar oczyszczonego DNA.
  3. Po ustaleniu stężenia, podwielokrotność 25 pmol oczyszczonego DNA przelać do probówki do mikrofuge o pojemności 0,6 ml i umieścić w wirówce próżniowej, aż roztwór będzie ledwo widoczny; zwykle jest to 30 minut do 1 godz.
    nuta: Substrat DNA jest teraz gotowy do złożenia nukleosomów. W przeciwnym razie protokół może zostać wstrzymany, a DNA przechowywane w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
  4. Umieścić probówkę do mikrofuge zawierającą DNA o stężeniu 25 pmol na lodzie i dodać składniki zespołu nukleosomów w tabeli 1, w podanej kolejności. Po dodaniu wszystkich składników wyjąć mieszaninę z lodu i inkubować w temperaturze pokojowej (RT) przez 30 minut.
    nuta: Niezwykle ważne jest, aby przy obliczaniu NaCl potrzebnego do osiągnięcia końcowego stężenia 2 M uwzględnić zawartość soli w buforze histonowym.
  5. Złożyć nukleosomy, zmniejszając stężenie soli 2 M w mieszaninie do 200 mM przy użyciu ciągłego rozcieńczania.
    1. Napełnić strzykawkę 100 μl buforu rozcieńczającego zawierającego 10 mM Tris pH 7,5 i umieścić ją na pompie strzykawkowej.
    2. Skierować igłę strzykawki przez wstępnie nakłuty otwór w nasadce probówki do mikrofuge, upewniając się, że dochodzi do kontaktu z mieszaniną montażową (Rysunek 1).
    3. Uruchomić pompę strzykawkową z szybkością 0,75 μl/min przez 120 min.
      nuta: Otrzymany roztwór o objętości 100 μl zawiera 250 nM nukleosomów i 200 mM NaCl.
    4. Przenieść mieszaninę do przycisku do dializy MWCO o temperaturze 10 K i dializować w 200 ml wstępnie schłodzonego (4 °C) buforu o niskiej zawartości soli, zawierającego 10 mM Tris pH 7,5, 0,25 mM EDTA i 2,5 mM NaCl, przez 1 godzinę w temperaturze 4 °C.
  6. Aby ocenić zawartość histonów w zespole nukleosomów, należy przygotować nieciągły żel SDS-PAGE z 15% separacją i 6% układaniem w stosy, jak opisano wcześniej.
    1. Podwielokrotność 10 - 20 μl wywaru nukleosomowego do probówki do mikrofuge i dodać 4x bufor do próbek Laemmli o stężeniu roboczym 1 - 2x.
    2. Jako kontrolę, powtórzyć ten preparat w osobnej probówce do mikrofuge dla 1 - 2 μg materiału histonowego. Podgrzewać próbki w temperaturze 95 °C przez ~ 5 minut.
    3. Załaduj próbki na sąsiednich pasach do siebie na żelu. Dodaj bufor próbki do nieużywanych linii, aby promować równomierną migrację pasma.
    4. Uruchom żel pod napięciem 65 V, aż czoło barwnika przesunie się przez żel do układania. Po osiągnięciu żelu rozdzielającego zwiększ go do 150 V i pracuj, aż czoło barwnika całkowicie wyprowadzi się z żelu.
    5. Zdemontuj jednostkę do elektroforezy i delikatnie przenieś żel do pojemnika barwiącego wypełnionego ddH2O. Pozostaw żel na 5 minut, delikatnie mieszając. Powtórz ten proces jeszcze dwa razy, za każdym razem używając świeżego ddH 2O.
      nuta: Bejca Coomassie zastosowana w tym protokole nie wymaga typowych kroków utrwalających potrzebnych do barwienia Coomassie (patrz Tabela materiałów). Jeśli używany jest inny preparat Coomassie, w razie potrzeby dostosuj kroki mocowania.
    6. Usuń wodę z ostatniego płukania i dodaj tyle plamy, aby pokryć żel. Pozostawić żel delikatnie mieszając przez co najmniej 1 godz.
      nuta: W celu mieszania pojemnik do barwienia można umieścić na dowolnym urządzeniu, które sprzyja ruchowi plamy po żelu, jednocześnie utrzymując żel pokryty płynem.
    7. Usuń plamę z pojemnika i spłucz żel ddH2O. Wymień ddH2O i moczyć żel przez 30 minut, delikatnie mieszając. (Żel powinien wyglądać tak, jak pokazano na rysunku 2, z wyraźnym oddzieleniem pasm histonowych).
  7. Przechowywać nukleosomy w temperaturze 4 °C do czasu użycia.
    nuta: Przechowywane w tych warunkach nukleosomy pozostają stabilne przez kilka miesięcy. W tym miejscu protokół można wstrzymać.

2. Szybkie obrazowanie poklatkowe AFM dynamiki nukleosomów

UWAGA: Poniższy protokół jest dostępny dla instrumentu HS-AFM opracowanego przez grupę Ando (Uniwersytet Kanazawa, Kanazawa, Japonia).

  1. Przygotuj APS-mica do obrazowania płynnego.
    1. Przymocuj szklany pręt do stolika skanera AFM za pomocą kleju do skanera pręta szklanego (patrz Tabela materiałów). Pozostaw do wyschnięcia na co najmniej 10 minut.
    2. Wykonaj okrągłe kawałki miki o grubości ~0,1 mm i średnicy 1,5 mm, wykrawając je z większego arkusza miki. Użyj kleju HS-AFM do prętów mikowych (patrz Tabela materiałów), aby przymocować ten kawałek miki do szklanego pręta na HS-AFM i wysuszyć, nietknięty przez co najmniej 10 minut. Odcinaj warstwy za pomocą taśmy wrażliwej na nacisk, aż na taśmie pojawi się dobrze rozcięta warstwa.
    3. Rozcieńczyć 1 μl 50 mM materiału APS w 99 μl dd H2O, aby uzyskać roztwór APS o stężeniu 500 μM. Umieść 2,5 μl tego roztworu na świeżo rozdrobnionej powierzchni miki i pozostaw do sfunkcjonalizowania przez 30 minut.
      nuta: Aby zapobiec wysuszeniu powierzchni podczas funkcjonalizacji, nasadkę stożkowej probówki wirówkowej o pojemności 50 ml można wyposażyć w wilgotny kawałek bibuły filtracyjnej i umieścić nad skanerem. Materiał APS jest rozcieńczany 3 razy mniej do obrazowania płynnego niż do obrazowania statycznego, aby kontrolować dynamikę do szybkości, którą można zaobserwować za pomocą AFM.
    4. Przepłukać mikę 20 μl ddH2O, stosując kilka ~3 μL płukania. Po każdym płukaniu całkowicie usuń wodę, umieszczając chusteczkę z włókniny na krawędzi miki. Po ostatnim płukaniu umieść ~3 μL ddH2Ona powierzchni i pozostaw na co najmniej 5 minut, aby usunąć wszelkie niespecyficznie związane APS.
  2. Umieść sondę w uchwycie HS-AFM i umieść uchwyt na stoliku AFM końcówką skierowaną do góry. Przepłukać utrwalacz za pomocą ~100 μL ddH2O, a następnie przepłukać dwa ~100 μL przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów o wielkości 0,22 μm, który zawiera 10 mM HEPES, pH 7,5 i 4 mM MgCl2.
  3. Po zakończeniu płukania napełnij komorę ~100 μL buforu do obrazowania nukleosomów, zanurzając końcówkę. Dostosuj pozycję wspornika, aż zostanie uderzony laserem. Przepłukać APS-mikę 20 μl przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, używając ~4 μl na płukanie.
  4. Rozcieńczyć 1 μl materiału montażowego nukleosomów w 250 μl przefiltrowanego buforu do obrazowania nukleosomów, aby uzyskać końcowe stężenie nukleosomów 1 nM. Umieść 2,5 μl tego rozcieńczenia na powierzchni i pozostaw na 2 minuty. Dwukrotnie spłukać powierzchnię ~ 4 μL buforu do obrazowania nukleosomów. Po ostatnim płukaniu pozostaw powierzchnię pokrytą w buforze do obrazowania.
    nuta: Jeśli powierzchnia nie zostanie spłukana po zdeponowaniu próbki nukleosomu, powierzchnia szybko stanie się przepełniona.
  5. Umieść skaner i próbkę na uchwycie końcówki tak, aby próbka była skierowana stroną zadrukowaną do dołu. Aby rozpocząć podejście, należy użyć funkcji automatycznego podejścia z amplitudą punktu zadanego, As zbliżoną do amplitudy swobodnej oscylacji A0.
    nuta: Idealnie, As = 0,95 A0, jednak praca na poziomie 82% A0 również zadziała, jeśli będziesz ostrożny.
  6. Dostosuj nastawę, aż powierzchnia będzie dobrze śledzona.
    nuta: Aby zminimalizować przenoszenie energii z końcówki AFM do próbki nukleosomu, amplituda wspornika powinna być utrzymywana na niskim poziomie, z optymalnymi amplitudami tak niskimi, jak 1 nm.
  7. Ustaw obszar obrazu w zakresie od 150 x 150 nm do 200 x 200 nm z szybkością akwizycji danych ~300 ms na klatkę obrazu.
    nuta: Ten rozmiar obrazu jest zwykle wystarczający do uchwycenia dynamiki kilku nukleosomów jednocześnie. Mniej zaludniona powierzchnia może wymagać zmian tych parametrów. Sugerowana liczba klatek na sekundę jest wystarczająca do uchwycenia dynamiki nukleosomów, takiej jak między innymi zapętlanie, przesuwanie i rozpakowywanie (patrz sekcja Reprezentatywne wyniki poniżej).

Tabela 1: Odczynniki potrzebne do ciągłego składania nukleosomów gradientu soli. Każdy z wymienionych składników dodaje się do probówki do mikrofuge zawierającej oczyszczone DNA. Należy to zrobić w kolejności, w jakiej odczynniki są wymienione w tabeli, z dodaniem najpierw wody i NaCl, a następnie dimeru H2A/H2B i tetrameru histonowego na końcu. Jeżeli mają być użyte wstępnie złożone oktamery histonowe, należy je dodać w takich samych proporcjach, jak w przypadku tetrameru powyżej. *Zwróć uwagę na zawartość NaCl w każdym z zapasów histonów i dostosuj 5M NaCl, aby odpowiednio dodać, końcowa [NaCl] powinna wynosić 2M. (Patrz Tabela materiałów).

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
Rysunek 1: Schemat pompy strzykawkowej używanej do montażu nukleosomów w mikroskali.Mieszaninę montażową umieszcza się w taki sposób, aby stykała się z końcem igły strzykawki. Gdy bufor rozcieńczający jest dostarczany przez pompę strzykawkową do mieszaniny montażowej, stężenie NaCl jest zmniejszane, co sprzyja składaniu nukleosomów. Rysunek ten został zaadaptowany z Stumme-Diers et al.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Oświadczenia

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
Nie stwierdzono konfliktu interesów.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule
NazwaFirmaNumer katalogowyKomentarze
Plazmid pGEM3Z-601Addgene, Cambridge, MassachusettsNumer katalogowy: 26656
Startery PCRIDT, Coralville, IANa zamówienie(FP) 5'- CAGTGAATTGTAATACGACTC-3'
(RP) 5'-ACAGCTATGACCATGATTAC-3'
Polimeraza DreamTaqThermoFischer Scientific, Waltham, MassachusettsEP0701Numer katalogowy dla 200 sztuk
Zestaw do oczyszczania PCRQiagen, Hilden, Niemcy Numer katalogowy: 28104Numer katalogowy dla 50 sztuk
Baza TrisSigma-Aldrich, St. Louis, MO10708976001Numer katalogowy dla 250 g
EdtaThermoFischer Scientific, Waltham, Massachusetts15576028Numer katalogowy dla 500 g
(CENP-A/H4)2, rekombinowany ludzkiEpiCypher, Durham, Karolina PółnocnaNumer katalogowy: 16-0010Numer katalogowy dla 50 ug
H2A/H2B, rekombinowany człowiekEpiCypher, Durham, Karolina PółnocnaNumer katalogowy: 15-0311Numer katalogowy dla 50 ug
Oktamer H3, rekombinowany człowiekEpiCypher, Durham, Karolina Północna16-0001Numer katalogowy dla 50 ug
Zestaw urządzeń do dializy Slide-A-Lyzer MINI, 10K MWCO, 0.1 mLThermoFischer Scientific, Waltham, MassachusettsNumer katalogowy: 69574Numer katalogowy dla 10 urządzeń
chlorek soduSigma-Aldrich, St. Louis, MOS9888-500GNumer katalogowy dla 500 mg
Filtry odśrodkowe Amicon Ultra-0,5 ml Millipore-sigma, Burlington, MissouriUFC501008Numer katalogowy dla 8 urządzeń
HclSigma-Aldrich, St. Louis, MO258148-25MLNumer katalogowy dla 25 ml
TrykotSigma-Aldrich, St. Louis, MOT0377-25GNumer katalogowy dla 25 g
SdsSigma-Aldrich, St. Louis, MO11667289001Numer katalogowy dla 1 kg
Nadsiarczan amonu (AmmPS) Bio-Rad, Herkules, KaliforniaNumer katalogowy: 1610700Numer katalogowy dla 10 g
30% roztwór akryloamidu/bis, 37,5:1Bio-Rad, Herkules, Kalifornia1610158Numer katalogowy dla 500 ml
TEMEDBio-Rad, Herkules, KaliforniaNumer katalogowy: 1610800Numer katalogowy dla 5 ml
4x bufor do próbek białka Laemmli dla SDS-PAGEBio-Rad, Herkules, Kalifornia1610747Numer katalogowy dla 10 ml
2-MESigma-Aldrich, St. Louis, MOZobacz materiał M6250-10MLNumer katalogowy dla 10 ml
PageRuler Prestained Drabinka białkowa ThermoFischer Scientific, Waltham, MassachusettsNumer katalogowy: 26616Numer katalogowy dla 500 uL
Bio-bezpieczna™ bejca CoomassieBio-Rad, Herkules, Kalifornia1610786Numer katalogowy dla 1 L
Chusteczki z włókniny do pomieszczeń czystych: TX604 TechniCloth TexWipe, Kernersvile, Karolina PółnocnaZobacz materiał TX604
Mika moskiewska blokowaAshevilleMica, Newport News, WirginiaStopień-1
Aminopropylosilatran (APS)Zsyntetyzowane zgodnie z opisem w 22
HEPESYSigma-Aldrich, St. Louis, MOH4034-25GNumer katalogowy dla 25 g
Taśma klejącaScotch-3M, St. Paul, MN
Aron Alpha Przemysłowy Klej KrazyToagosei America, West Jefferson, OhioZobacz materiał AA480Numer katalogowy tubki 2 g
MgCl2Sigma-Aldrich, St. Louis, MOZobacz materiał M8266-100GNumer katalogowy dla 100 g
Filtr Millex-GP, 0,22 μmSigma-Aldrich, St. Louis, MOSLGP05010Numer katalogowy dla 10 urządzeń
Sonda BL-AC10DS-A2 afm (do HS-AFM)Olympus, Japonia
Związek FG-3020C-20 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia
Związek FS-1010S135-0.5 FluoroTechnology Co., Ltd., Kagiya, Kasugai, Aichi, Japonia
Szybka poklatkowa mikroskopia sił atomowychToshio Ando, Instytut Nauk o Nano-Życiu, Uniwersytet Kanazawa, Kakuma-machi, Kanazawa, Japonia
powiedział: powiedział:

Przedruki i uprawnienia

Poproś o pozwolenie na ponowne wykorzystanie tekstu lub ilustracji tego artykułu JoVE

Poproś o pozwolenie

Tagi

rozwijanie DNAszybka mikroskopia si atomowych AFMpod o e z mikiobrazowanie nukleosom wugi cie wspornikardze histonowywysoko nukleosomuobrazowanie poklatkowe

Powiązane artykuły