$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Fiksacja pierwotna, fiksacja po utrwaleniu, osadzanie, dzielenie na sekcje i kontrastowanie
- Przygotować 1,6 ml pierwotnego roztworu utrwalającego (2,5% aldehydu glutarowego w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3)) w probówce do mikrowirowania o pojemności 2 ml. Przechowywać w temperaturze 5 °C maksymalnie 14 dni.
- Z biopsji mięśnia lub całego mięśnia wyizoluj małą próbkę, która ma maksymalną średnicę 1 mm w dowolnym kierunku i jest nieco dłuższa w kierunku włókien podłużnych niż w przekroju poprzecznym (w celach orientacyjnych).
- Umieścić próbkę w probówce zawierającej zimny roztwór do utrwalania pierwotnego. Przechowywać w temperaturze 5 °C przez 24 godziny.
- Przemyć próbkę czterokrotnie (15 minut między każdym myciem) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3). Za pomocą pipet transferowych usunąć zużyty bufor z probówki, pozostawiając próbkę nietkniętą, a następnie dodać świeży bufor.
nuta: Po ostatnim przemyciu próbka może być przechowywana w 0,1 M buforze kakodylanu sodu w temperaturze 5 °C przez kilka miesięcy. W tym miejscu protokół można wstrzymać.
- Postfix z 1% tetratlenkiem osmu (OsO4) i 1,5% żelazocyjankiem potasu (K4Fe(CN)6) w 0,1 M buforze kakodylanu sodu (pH 7,3) przez 120 minut w temperaturze 4 °C.
nuta: Zastosowanie 1,5% żelazocyjanku potasu (K4Fe(CN)6) jest niezbędne dla uzyskania optymalnego kontrastu cząstek glikogenu.
- Spłucz dwukrotnie w podwójnie destylowanej wodzie o temperaturze pokojowej (RT).
- Odwodnić przez zanurzenie w stopniowanej serii alkoholu (etanolu) w temperaturze pokojowej przy użyciu następujących stężeń: 70% (10 min), 70% (10 min), 95% (10 min), 100% (10 min) i 100% (10 min).
nuta: Na każdym etapie próbka jest zanurzana w etanolu, który jest następnie usuwany tylko częściowo, aby uniknąć wysuszenia próbki. Na koniec resztki etanolu są wyrzucane.
- Naciekać stopniowanymi mieszaninami tlenku propylenu i żywicy eposydowej w temperaturze pokojowej przy użyciu następujących proporcji objętościowych (tlenek propylenu/żywica eposydowa): 1/0 (10 min), 1/0 (10 min), 3/1 (45 min), 1/1 (45 min), 1/3 (45 min), 0/1 (przez noc). Następnego dnia zanurzyć próbki w 100% świeżej żywicy epossydowej w formach i polimeryzować w temperaturze 60 °C przez 48 godzin.
- Wytnij ultracienkie (60-70 nm) odcinki włókien zorientowanych wzdłużnie i zbierz je na jednootworowych siatkach miedzianych w następujący sposób.
- Zamontuj blok próbki na uchwycie ultramikrotomu.
- Przytnij blok na powierzchni żyletką, aby dotrzeć do poziomu tkanki.
- Zamontuj nóż diamentowy (ultra cut 45) przed próbką i wyrównaj powierzchnię próbki równolegle do noża.
- Za pomocą noża diamentowego należy wykonać półcienki (1 μm) wycinek, aby sprawdzić orientację próbki. Wybarwić półcienki wycinek błękitem toluidynowym do obserwacji za pomocą mikroskopii świetlnej.
- Przytnij blok jeszcze bardziej, aby zmniejszyć obszar zainteresowania w celu uzyskania odpowiednich ultracienkich sekcji.
- Wycinaj ultracienkie (60-70 nm) odcinki drugim nożem diamentowym (ultra cut 45).
- Zbierz 1-2 sekcje na miedzianych siatkach z jednym otworem za pomocą Perfect Loop.
nuta: Siatka miedziana z jednym otworem ma pojedynczy otwór pośrodku z membraną nośną Formvar.
- Skontrastuj skrawki octanem uranylu i cytrynianem ołowiu, zanurzając powyższe siatki w roztworze octanu uranylu (0,5% w wodzie podwójnie destylowanej) na 20 minut, a następnie w roztworze cytrynianu ołowiu (1% w wodzie podwójnie destylowanej) na 15 minut. Umyj kratki w wodzie podwójnie destylowanej między dwoma plamami i po nich.
nuta: W tym miejscu protokół można wstrzymać.
2. Obrazowanie
- Włącz transmisyjny mikroskop elektronowy (pracujący przy napięciu przyspieszającym 80 kV), komputer i oprogramowanie do rejestracji obrazu. Rejestruj obrazy cyfrowe za pomocą cyfrowej kamery CCD 2 k x 2 k z powolnym skanowaniem i powiązanego oprogramowania do obrazowania.
- Włóż siatkę z wieloma sekcjami do stolika mikroskopu.
- Przesiewaj siatkę początkowo w małym powiększeniu (np. x100), aby określić jakość przekrojów (tj. otworów w membranie nośnej, gruzu itp.) i wybrać sekcje najlepszej jakości. Przy małym powiększeniu określ kierunek włókien mięśniowych.
- Następnie zwiększ powiększenie z wiązką wyśrodkowaną na włóknie obwodowym w przekroju. Ustaw ostrość obrazu przy powiększeniu powyżej 30 k, aby zapewnić wystarczającą ilość drobnych szczegółów na obrazie, kierując się szybką transformacją Fouriera w czasie rzeczywistym, jeśli jest dostępna. Na koniec zapisz obrazy z czasem naświetlania 1 s przy żądanym powiększeniu.
- Uzyskaj w sumie 24 obrazy losowo wybranego włókna, tj. 12 obrazów przestrzeni miofibrylarnej i 12 obrazów przestrzeni podsarkolemmalnej, w powiększeniu od 10 k do 40 k. Upewnij się, że obrazy są rozmieszczone na całej długości i szerokości włókna w randomizowanej, ale systematycznej kolejności, aby uzyskać bezstronne wyniki (Rysunek 1A).
nuta: Optymalne powiększenie zależy od dostępnej rozdzielczości kamery i wielkości mikrofotografii. Celem jest osiągnięcie ostatecznej rozdzielczości, w której średnice cząstek glikogenu mogą być mierzone w krokach co 1 nm i obejmują całkowitą powierzchnię obszaru miofibrylarnego wynoszącą co najmniej 70μm2 oraz całkowitą długość włókna wynoszącą co najmniej 25 μm rozłożoną na 12 obrazów przestrzeni miofibrylarnej i 12 obrazów przestrzeni subsarkolemmalnej na włókno, odpowiednio. 24 obrazy na włókno najprawdopodobniej dadzą precyzję (współczynnik błędu) objętościowej zawartości różnych pul glikogenu od 0,1 do 0,2 w pojedynczych włóknach z mięśni szkieletowych ludzi, szczurów i myszy (ryc. 2E).
- Powtarzaj kroki 2.4 i 2.5, aż do zobrazowania łącznie 6-10 włókien. W razie potrzeby wytnij dodatkowe odcinki (oddalone od siebie o co najmniej 150 μm, aby uniknąć nakładania się już zobrazowanych włókien) i powtórz kroki 1,9-2,5.
3. Analizy obrazów
- Zaimportuj obrazy do ImageJ, klikając Plik > Otwórz.
- Ustaw skalę globalną tak, aby odpowiadała oryginalnemu rozmiarowi obrazu, klikając Analizuj > Ustaw skalę.
- Powiększ o 100%, klikając Obraz > Powiększ >
.
- Zmierz grubość jednego dysku Z na obraz przestrzeni miofibrylarnej (12 na włókno) za pomocą narzędzia Linia prosta z menu Narzędzia (Rysunek 1D). Oblicz średnią grubość dysku Z każdego z 6-10 włókien.
- Zdefiniuj 2-3 włókna z najgrubszym średnim dyskiem Z jako włókna typu 1 i 2-3 włókna z najcieńszym średnim dyskiem Z jako włókna typu 2. Zignoruj pośrednie 2-4 włókna do dalszych analiz (rysunek 1E).
UWAGA: Poniższe kroki powtarza się dla każdego z 4-6 włókien z próbki. Frakcje objętościowe glikogenu szacuje się przez zliczanie punktów. Wielkość siatek dobierana jest w taki sposób, aby uzyskać zadowalająco wysoką precyzję oszacowań. Często uzyskuje się to poprzez osiągnięcie 250 trafień, co następnie dyktuje całkowitą liczbę potrzebnych punktów, a co za tym idzie, obszar na punkt.
- Użyj narzędzia Linia segmentowana, aby zmierzyć długość najbardziej zewnętrznej miofibryli widocznej tuż poniżej obszaru podsarkolemmalnego (Rysunek 2A).
nuta: Długość ta służy do wyrażenia glikogenu podsarkolemmalnego na powierzchnię (tj. długość najbardziej zewnętrznego miofibrylu pomnożona przez grubość przekroju (60 nm); patrz krok 4.5). W związku z tym w analizie uwzględniany jest tylko obszar podsarkolemmalny, który jest reprezentowany przez tę długość.
- Wstaw siatkę, klikając Analyze > Tools > Grid i ustaw Obszar na punkt na 32 400 nm2. Policz liczbę trafień w dostępnej długości na 12 obrazach podsarkolemmalnych, w których krzyż uderza w glikogen podsarkolemmalny (ryc. 2A). Trafienie definiuje się jako cząsteczkę glikogenu znajdującą się w prawym górnym rogu krzyża.
- Wstaw siatkę, klikając Analizuj > Narzędzia > Siatka i ustaw Obszar na punkt na 160 000 nm2. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w przestrzeń wewnątrzmiofibrylarną (ryc. 2B).
- Wstaw siatkę, klikając Analizuj narzędzia > > siatkę i ustaw Obszar na punkt na 3,600 nm2. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen wewnątrzmiofibrylarny (ryc. 2C).
- Wstaw siatkę, klikając Analyze > Tools > Grid i ustaw Obszar na punkt na 32 400 nm2. Policz liczbę trafień na 12 obrazach miofibrylarnych, w których krzyż uderza w glikogen międzymiofibrylarny (ryc. 2D).
- Korzystając z narzędzia Linia prosta, zmierz średnicę pięciu losowo wybranych cząstek glikogenu z każdej puli dla każdego z 12 obrazów, aby uzyskać średnio 60 cząstek na pulę na włókno.
UWAGA: Średnia 60 cząstek w dużej mierze pokrywa zmienność we włóknie (rysunek 2F).
