1. Linia komórkowa i hodowla komórkowa
- Hoduj makrofagi RAW 264.7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (vol/vol) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 . Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.
- Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj płytkę dwa razy za pomocą sterylnego PBS.
- Odłączyć komórki, dodając 1 000 μl 0,5% trypsyny-EDTA i inkubować płytkę do hodowli komórkowej przez 3-5 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
- Zbadaj płytkę pod mikroskopem świetlnym, aby potwierdzić dysocjację komórek. Dodaj 10 ml pożywki wzrostowej zawierającej 10% FBS, aby dezaktywować trypsynę.
- Zebrać zawiesinę komórek do stożkowej probówki o pojemności 50 ml i odwirować przy 400 x g przez 5 minut w temperaturze pokojowej. Delikatnie zawiesić komórki w kompletnym pożywce do hodowli komórkowych i określić liczbę komórek oraz żywotność za pomocą barwienia błękitem trypanowym (0,4%).
nuta: Zalecana minimalna żywotność komórek w tym eksperymencie wynosi >90%.
- Umieść sterylne szklane szkiełka nakrywkowe w dołkach na 24-dołkowej płytce za pomocą autoklawowanych kleszczy. Komórki nasienne na szkiełkach nakrywkowych o gęstości 1 x 106 komórek/ml i inkubować płytkę przez noc w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO2 .
- Przed poddaniem działaniu należy zmienić pożywkę w każdym dołku na świeżą, kompletną pożywkę o pojemności 500 μl. Wstępnie potraktuj makrofagi podłożem (DMSO lub innymi rozpuszczalnikami stosowanymi do rozpuszczania EIPA) lub inhibitorem makropinocytozy 5-(N-etylo-N-izopropylo)-amilorydem (EIPA, 25 μM) przez 30 minut.
- Traktuj komórki nośnikiem i stymulatorami makropinocytozy, aby promować marszczenie błony: 12-mirystynianem 13-octanu forbolu (PMA, 1 μM, 30 min) i czynnikiem stymulującym tworzenie kolonii makrofagów (M-CSF, 100 ng / ml, 30 min).
nuta: Alternatywne inhibitory makropinocytozy [np. latrunkulina A (1 μM, 30 min) lub cytochalazyna D (1 μM, 30 min)] i stymulatory [np. naskórkowy czynnik wzrostu (EGF, 100 ng/ml, 10 min) lub płytkowy czynnik wzrostu (PDGF, 100 ng/ml, 15 min)] makropinocytozy mogą być również stosowane do charakteryzowania makropinocytozy w makrofagach i innych typach komórek. Komórki mogą wymagać głodzenia surowicy przez noc przed leczeniem fizjologicznymi stymulatorami makropinocytozy. Ważne jest, aby pamiętać, że najskuteczniejsze stężenia i czasy inkubacji będą musiały zostać określone, aby stymulować makropinocytozę w innych typach komórek.
2. Utrwalenie SEM
- Po zabiegu odessać pożywkę ze studzienek i dwukrotnie zmyć szkiełka nakrywkowe lodowatym PBS.
- Utrwalić komórki (4% paraformaldehydu i 2% aldehydu glutarowego w 0,1 M kakodylanu sodu) przez 30 minut w temperaturze pokojowej, a następnie przez noc inkubować w utrwalaczu w temperaturze 4 °C.
- Delikatnie przemyć i inkubować szkiełka nakrywkowe z 500 μl następujących odczynników, nie naruszając monowarstwy komórek.
- Przemyć raz w 0,1 M kakodylan sodu i inkubować przez 15 minut.
- Przemyć dwukrotnie dH2O z 10 minutową inkubacją w każdym praniu.
- Przemyć dwukrotnie 25% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
- Przemyć dwukrotnie 50% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
- Przemyć dwukrotnie 75% etanolem w 10-minutowej inkubacji w każdym praniu.
- Przemyć dwukrotnie 80% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
- Przemyć dwukrotnie 95% etanolem w 10 minutowej inkubacji w każdym praniu.
- Umyć dwukrotnie 100% etanolem. Wykonuj 10 minut inkubacji w każdym praniu.
nuta: Wymiana/wymiana odczynników powinna odbywać się szybko, aby zapobiec wysuszeniu komórek powietrzem. Szkiełka nakrywkowe można pozostawić w 100% etanolu na kilka dni w temperaturze 4 °C. W przypadku długotrwałego przechowywania należy dodać dodatkowe 100% etanolu i przykryć studzienki parafilmem, aby zapobiec wysuszeniu próbki na powietrzu.
3. Suszenie w punkcie krytycznym
- Umieść szkiełka nakrywkowe w suszarce Critical Point Dryer i przykryj je 100% etanolem. Naciśnij przycisk zasilania i otwórz zbiornik CO2 .
- Naciskać przycisk Cool przez około 30 s, aż temperatura spadnie do 0 °C. Naciskaj przycisk Fill, aż w okienku komory pojawi się bańka.
- Naciskaj przycisk Przedmuchiwanie, aż zniknie zapach etanolu z wydechu odpowietrzającego. Naciśnij ponownie przycisk Chłodzenie, aż temperatura spadnie do 0 °C.
- Ponownie naciśnij przyciski napełniania i oczyszczania, aby je wyłączyć i zamknąć zbiornik CO2. Ponownie naciśnij przycisk Chłodzenie, aby go wyłączyć, a następnie naciśnij przycisk podgrzewania.
- Ustawić temperaturę na 42 °C, a ciśnienie na 1 200 psi. Gdy ciśnienie i temperatura ustabilizują się, naciśnij przycisk odpowietrzania, aby umożliwić powolny spadek ciśnienia.
- Gdy ciśnienie w komorze osiągnie 150 psi, naciśnij przycisk Vent i poczekaj, aż ciśnienie spadnie do 0 psi. Wyłącz suszarkę do punktu krytycznego i usuń szkiełka nakrywkowe.
- Zamontuj szkiełka nakrywkowe na próbkach aluminiowych SEM za pomocą zakładek Carbon Adhesive i poddaj powłoce napylającej za pomocą złota/palladu w powlekarce napylającej.
- Włącz przycisk zasilania i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 mTorr. Przepłucz komorę, aby usunąć wilgoć i powietrze, wyłączając przełącznik gazu i obracając zawór gazu Fine w kierunku przeciwnym do ruchu wskazówek zegara.
- Gdy podciśnienie wzrośnie do 200 mTorr, wyłącz przełącznik gazu i poczekaj, aż podciśnienie osiągnie 30 mTorr. Powtórz ten krok 3 razy.
- Naciśnij przycisk Timer i wyreguluj Voltage pokrętło, aż miernik wskaże 10 mA. Wyjąć powlekane szkiełka nakrywkowe z komory.
nuta: Postępuj zgodnie z instrukcjami producenta, aby wykonać suszenie w punkcie krytycznym i napylanie napylania próbki.
4. Obrazowanie i kwantyfikacja
- Włóż szkiełka nakrywkowe z próbką do komory skaningowego mikroskopu elektronowego. Zamknij drzwi i naciśnij przycisk EVAC.
- Otwórz oprogramowanie operacyjne SEM. Ustaw napięcie przyspieszania na 15 kv i odległość roboczą na 10 mm.
- Naciśnij przycisk Współrzędne i poruszaj się po kontrolerze, aż komórki pojawią się na środku ekranu obserwacji. Ustaw powiększenie na 3,500x i zobrazuj próbkę, klikając przycisk Zdjęcie.
nuta: Użyj wyższego poziomu powiększenia (od 8 500x do 16 000x), aby pokazać błonę plazmatyczną z większą szczegółowością.
