Kwantyfikacja powstawania falban błonowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej

Abstract

Źródło: Ahn, W. et al., Wizualizacja powstawania falban błonowych za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej.J. Vis. Exp. (2021)

Ten film pokazuje przygotowanie próbki, utrwalenie i obrazowanie komórki makrofagowej, która wykazuje zmarszczki błony za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej, SEM. Szczegółowe informacje na temat morfologii i organizacji błony są kluczowe dla zrozumienia stanu fizjologicznego komórek.

Protocol

1. Linia komórkowa i hodowla komórkowa

1. Hoduj makrofagi RAW 264.7 w zmodyfikowanym pożywce Eagle Medium (DMEM) firmy Dulbecco uzupełnionej 10% (vol/vol) inaktywowaną termicznie płodową surowicą bydlęcą (FBS), 100 IU / ml penicyliny i 100 μg / ml streptomycyny w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C i 5% CO₂ . Wymieniaj pożywkę wzrostową co drugi dzień.
2. Gdy komórki zlewają się w 80%, umyj płytkę dwa razy za pomocą sterylnego PBS.
3. Odłączyć komórki, dodając 1 000 μl 0,5% trypsyny-EDTA i inkubować płytkę do hodowli komórkowej przez 3-5 minut w wilgotnym inkubatorze w temperaturze 37 °C.
4. Zbadaj płytk....

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0,5% trypsyna-EDTA	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 15400-054
2% Aldehyd glutarowy	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 16320
4% paraformaldehydu	Biotechnologia Santa Cruz	281692
5-(N-etylo-N-izopropylo)-amiloryd	Sigma Nauki przyrodnicze	A3085
Zakładki samoprzylepne węglowe	Nauki o mikroskopii elektronowej	Nr kat. 77825-09
Dimetylosulfotlenek	Corning	25-950-CQC
Zmodyfikowany Orzeł Dulbecco Medium	Cytiva Nauki Przyrodnicze	SH30022.01
Falcon 24-well Przezroczysta, wielodołkowa płytka do hodowli komórkowej z płaskim dnem i powłoką TC	sokół	353047
Surowica bydlęca płodu	Bliźnięta Życiorys	900-108
Inkubator CO2 HERAcell 150i	Thermo Fisher Naukowy	51026282
Hummer Model 6.2 Napylarka	Anatech Stany Zjednoczone	Numer katalogowy: 58565
Skaningowy mikroskop elektronowy JSM-IT500HR
Szklana osłona mikroskopu	Thermo Fisher Naukowy	Numer katalogowy: 12-545-82
Pióro Strep	Gibco (firma Gibco)	Rozdział 15140-122
12-mirystynian 13-octanu forbolu	Millipore Sigma	Numer katalogowy: 524400
RAW 264.7 makrofagi	Kontroler ATCC (Kontroler T	ATCC TIB-71
Rekombinowany ludzki M-CSF	Peprotech	300-25
Suszarka do punktów krytycznych Samdri-790	Korporacja Badawcza Tousimis	8778 mld
Aluminiowe mocowania próbek SEM	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer telefonu 75220
Kakodylan sodu	Nauki o mikroskopii elektronowej	Numer katalogowy: 12300
Roztwór błękitu trypanowego	Thermo Fisher Naukowy	15250061