$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury z udziałem ludzi zostały przeprowadzone zgodnie z instytucjonalnymi, krajowymi i międzynarodowymi wytycznymi dotyczącymi dobrobytu ludzi i zostały sprawdzone przez lokalną komisję rewizyjną instytucji.
1. Przygotowanie cytospinów
- Przygotować dwa cytospiny z komórkami jednojądrzastymi próbek pacjenta (tj. jeden cytospin do barwienia immunofluorescencyjnego γH2AX i jeden cytospin do połączonego barwienia immunofluorescencyjnego γH2AX i 53BP1) przez odwirowanie (300 x g, 10 min) 1,0 x 105 komórek dla każdego preparatu (ryc. 1 i 2).
2. γH2AX i 53BP1 Barwienie immunofluorescencyjne
- Utrwalanie i przenikanie: Utrwalić komórki za pomocą 200 μl 4% PFA przez 10 minut. Po utrwaleniu delikatnie przemyj komórki trzy razy 30 ml PBS przez 5 minut każdy na wytrząsarce laboratoryjnej. Następnie przepuszczaj komórki za pomocą 200 μl 0,1% oktoksynolu 9 przez 10 minut. Delikatnie umyj komórki trzy razy 30 ml 5% roztworu blokującego przez 5 minut każda na wytrząsarce laboratoryjnej. Zablokuj komórki w 30 ml świeżego 5% roztworu blokującego na 1 godzinę.
- Inkubacja z przeciwciałami
- Inkubować jeden preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-γH2AX (1:500), a drugi preparat komórek z mysim przeciwciałem monoklonalnym anty-γH2AX (1:500) i poliklonalnym króliczym przeciwciałem anty-53BP1 (1:500) przez noc w temperaturze 4 °C.
- Po inkubacji delikatnie przemyć komórki 3 razy 30 ml 2% roztworu blokującego na każde 5 minut na wytrząsarce laboratoryjnej.
- Usunąć roztwór blokujący i inkubować pierwszy preparat komórek z sprzężonym z Alexa488 kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim (1:500), a drugi preparat komórek z koniugowanym kozim przeciwciałem drugorzędowym przeciwko mysim przeciwciałom przeciw mysim (1:500) i sprzężonym z Alexa555 przeciwciałem drugorzędowym przeciwko królikowi osła (1:500) przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Podłoże montażowe: Umieść szkiełko z komórkami w misce i delikatnie umyj komórki trzy razy 30 ml PBS na każde 5 minut na wytrząsarce laboratoryjnej. Usunąć PBS i zamontować komórki za pomocą pożywki montażowej zawierającej 4,6-diamidyno-2-fenyloindol. Ostrożnie umieść szkiełko nakrywkowe na podłożu montażowym, aby nie osadzały się pęcherzyki powietrza. Odczekać co najmniej 3 godziny na utwardzenie podłoża montażowego przed analizą komórek za pomocą mikroskopii fluorescencyjnej.
3. Analiza ognisk γH2AX i 53BP1
- Mikroskopia fluorescencyjna: Analizuj ogniska γH2AX i 53BP1 w jądrach komórkowych za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego wyposażonego w filtry dla DAPI, Alexa 488 i Cy3 podczas obrazowania przy 100-krotnym powiększeniu obiektywu. Rejestruj obrazy za pomocą aparatu i przetwarzaj je za pomocą odpowiedniego oprogramowania do obrazowania.
