$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Produkcja 15N, 13C-Tau (Rysunek 1)
- Rekombinowany plazmid ekspresji T7 pRANSFORM pET15b-Tau do kompetentnych komórek bakteryjnych Escherichia coli BL21(DE3).
UWAGA: cDNA kodujące najdłuższą (441 reszt aminokwasowych) izoformę Tau jest klonowana między miejscami restrykcyjnymi NcoI i XhoI w plazmidzie pET15b.
- Delikatnie wymieszaj 50 μl kompetentnych komórek BL21(DE3), tworząc 1-5 x 107 kolonii na μg plazmidowego DNA, ze 100 ng plazmidowego DNA w plastikowej probówce o pojemności 1,5 ml.
nuta: Zoptymalizowane pod kątem użycia kodonów szczepy bakteryjne do ekspresji eukariotycznego cDNA nie są niezbędne do produkcji ludzkiego Tau.
- Umieścić mieszaninę komórek na lodzie na 30 minut, a następnie szok termiczny przez 10 sekund w temperaturze 42 °C. Umieścić probówkę z powrotem na lodzie na 5 minut i dodać 1 ml pożywki LB (Luria-Bertani) o temperaturze pokojowej. Zawiesinę bakteryjną inkubować w temperaturze 37 °C przez 30 minut pod delikatnym mieszaniem.
- Rozprowadzić za pomocą pętli inokulacyjnej 100 μl zawiesiny komórkowej równomiernie na płytce agarowej z pożywką LB zawierającą 100 μg/ml antybiotyku ampicyliny.
- Inkubować płytkę selekcyjną przez 15 godzin w temperaturze 37 °C.
- Przechowywać płytkę selekcyjną w temperaturze 4 °C do momentu przejścia do etapu hodowli, maksymalnie przez około 2 tygodnie.
UWAGA: można przygotować zapas glicerolu w kulturze bakteryjnej (50% glicerolu), przechowywany w temperaturze -80 °C, w celu rozpoczęcia hodowli na późniejszym etapie.
- Dodać 1 ml 1 M MgSO4, 1 ml 100 mM CaCl2, 10 ml 100x dopełniacz witaminowy MEM, 1 ml 100 mg/ml ampicyliny do 1 l autoklawowanych soli M9 (6 g Na2HPO4, 3 g KH2PO4, 0,5 g NaCl).
nuta: Po dodaniu roztworu CaCl2 do soli M9 utworzy się biały osad, który szybko się rozprasza.
- Rozpuścić 300 mg pożywki 15N, 13C-complete, 1 g 15NH4Cl i 2 g 13C6-glukozy w 10 ml pożywki M9. Przefiltrować i wysterylizować roztwór izotopowy za pomocą filtra 0,2 μm, bezpośrednio do pożywki M9.
- Zawiesić za pomocą pętli inokulacyjnej jedną kolonię bakterii przekształconych w pET15b-Tau z płytki selekcyjnej w 20 ml pożywki LB uzupełnionej 100 μg/ml ampicyliny.
- Inkubować zaszczepioną pożywkę w temperaturze 37 °C przez około 6 godzin.
- Zmierzyć gęstość optyczną przy 600 nm (OD600) na 1 ml dziesięciokrotnego rozcieńczenia kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru.
nuta: Zmętnienie kultury bakteryjnej odpowiadające OD600 wynoszące 3,0-4,0 wskazuje, że osiągnięto fazę wzrostu nasycenia.
- Dodać 20 ml nasyconej kultury LB do 1 l pożywki wzrostowej M9 uzupełnionej ampicyliną (100 μg/ml stężenie końcowe) do 2-litrowej plastikowej kolby hodowlanej Erlenmeyera.
- Umieścić kolbę hodowlaną w programowalnym inkubatorze ustawionym na 10 °C i 50 obr./min. Zaprogramuj inkubator tak, aby przełączał się na 200 obr./min i 37 °C wcześnie rano następnego dnia.
- Zmierzyć OD600 na 1 ml kultury bakteryjnej w plastikowej kuwecie spektrometru. Dodać 400 μl 1 M roztworu podstawowego IPTG (izopropylo β-D-1-tiogalaktopiranozydu) (przechowywanego w temperaturze -20 °C), gdy OD600 osiągnie wartość około 1,0, w celu wywołania ekspresji rekombinowanego białka Tau.
- Kontynuować inkubację w temperaturze 37 °C przez kolejne 3 godziny. Zebrać komórki bakteryjne przez odwirowanie w temperaturze 5 000 x g przez 20 minut.
- Zamrozić granulat bakteryjny w temperaturze -20 °C. Przechowywać w stanie zamrożonym do momentu oczyszczenia, w razie potrzeby przez dłuższy czas.
2. Oczyszczanie 15N, 13C-Tau (Rysunek 2)
- do oczyszczania kationowymiennego w autoklawie (CEX) w temperaturze 121 °C pod ciśnieniem 15 psi przez 20 minut. Przechowywać w temperaturze 4 °C.
- Rozmrozić osad komórek bakteryjnych i dokładnie zawiesić w 45 ml ekstrakcji Bufor CEX A (50 mM NaPi, bufor pH 6,5, 1 mM EDTA) świeżo uzupełniony koktajlem inhibitorów proteazy 1x (1 tabletka) i DNAseI (2,000 jednostek).
- Rozbić komórki bakteryjne za pomocą homogenizatora wysokociśnieniowego o ciśnieniu 20 000 psi. Konieczne są 3-4 przejścia. Wirować przy 20 000 x g przez 40 minut w celu usunięcia nierozpuszczalnego materiału.
- Podgrzewać ekstrakt z komórek bakteryjnych przez 15 minut w temperaturze 75 °C w łaźni wodnej.
UWAGA: po kilku minutach obserwuje się biały osad.
- Wirować przy 15 000 x g przez 20 minut i utrzymywać supernatant zawierający stabilne termicznie białko Tau.
W - razie potrzeby przechowywać w temperaturze -20 °C do następnego etapu oczyszczania.
- Przeprowadzić chromatografię kationowymienną na mocnej żywicy CEX wypełnionej jako kolumna ze złożem o pojemności 5 ml przy użyciu systemu szybkiej chromatografii cieczowej białek (FPLC) (Rysunek 3 A).
- Ustawić natężenie przepływu na 2,5 ml/min.
- Zrównoważyć kolumnę w buforze CEX A
- Załadować 60-70 ml podgrzanego ekstraktu zawierającego Tau za pomocą pompy do próbki lub alternatywnie pompy A, w zależności od systemu. Pobrać przepływ do analizy w celu sprawdzenia, czy białko Tau skutecznie wiąże się z żywicą (patrz 2.8).
- Przepłukać żywicę buforem CEX A, aż absorbancja przy 280 nm powróci do wartości wyjściowej.
- Eluować Tau z kolumny za pomocą trzystopniowego gradientu NaCl otrzymanego przez stopniowe zwiększanie buforu CEX B (bufor CEX A z 1 M NaCl). Zaprogramuj FPLC w następujący sposób: pierwszy krok gradientu do 25% bufora CEX B w 10 objętościach kolumn (CV), aby osiągnąć 250 mM NaCl, drugi krok do 50% bufora CEX B w 5 CV, aby osiągnąć 500 mM NaCl, a trzeci krok do 100% bufora CEX B w 2 CV, aby osiągnąć 1 M NaCl. Zebrać 1,5 ml frakcji podczas etapów elucji.
- Przeanalizować 10 μl frakcji zebranych na etapie elucji za pomocą SDS-PAGE (12% SDS-akryloamidowy żel) i barwienia Coomassie (ryc. 3 A). Sprawdź również stopień załadunku kolumny, analizując 10 μl przepływu.
- Wybierz frakcje zawierające Tau i połącz te frakcje w następnym kroku.
- Przeprowadzić wymianę buforową na frakcjach zbiorczych zawierających Tau (Rysunek 3 B).
- Zrównoważyć kolumnę odsalającą z 53 ml złoża wypełnionego żywicą G25 (26 x 10 cm) w 50 mM wodorowęglanu amonu (bufor lotny) za pomocą systemu FPLC.
- Ustawić natężenie przepływu na 5 ml/min. Wstrzyknąć próbkę Tau do kolumny za pomocą pętli iniekcyjnej o pojemności 5 ml. Zebrać frakcje odpowiadające pikowi absorpcji przy 280 nm.
- Powtórzyć wstrzyknięcie 3-4 razy, w zależności od objętości początkowej puli CEX.
- Obliczyć ilość oczyszczonego białka Tau, wykorzystując pole piku chromatogramu przy 280 nm (1 mg Tau odpowiada 140 mAU*ml).
nuta: Współczynnik ekstynkcji białka Tau przy 280 nm wynosi 7 550 M-1 cm-1. Tau nie zawiera żadnych pozostałości Trp.
- Zbierz wszystkie frakcje Tau.
- Podwielokrotność próbki rozmieścić w probówkach zawierających równoważnik 1-5 mg Tau. Należy wybrać te probówki tak, aby objętość roztworu była mała w porównaniu z objętością probówki (na przykład 5 ml roztworu w probówce o pojemności 50 ml).
- Przebij otwory w nakrętkach probówek za pomocą igły. Próbki Tau należy zamrozić w temperaturze -80 °C.
- Liofilizuj próbki Tau. Liofilizowane białko Tau może być przechowywane w temperaturze -20 °C przez długi czas.
3. Fosforylacja in vitro 15N-Tau
- Rozpuścić 5 mg liofilizowanego Tau w 500 μl buforu do fosforylacji (50 mM Hepes·KOH, pH 8,0, 12,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA, 50 mM NaCl).
- Dodać 2,5 mM ATP (25 μl 100 mM roztworu podstawowego utrzymywanego w temperaturze -20 °C), 1 mM DTT (1 μl 1 M roztworu podstawowego utrzymywanego w temperaturze -20 °C), 1 mM EGTA (2 μl 0,5 M roztworu podstawowego), 1 x koktajl inhibitora proteazy (25 μl z 40 x roztworu podstawowego otrzymanego przez rozpuszczenie 1 tabletki w 1 ml buforu fosforylacyjnego) i 1 μM aktywowany His-ERK2 (250 μl w buforze konserwującym 10 mM Hepes, pH 7,3, 1 mM DTT, 5 mM MgCl2, 100 mM NaCl i 10% glicerolu, przechowywanym w temperaturze -80 °C) w całkowitej objętości próbki 1 ml.
nuta: Aktywowany His-ERK2 może być wytwarzany we własnym zakresie przez fosforylację kinazą MEK.
- Inkubować przez 3 godziny w temperaturze 37 °C.
- Podgrzewać próbkę w temperaturze 75 °C przez 15 minut w celu inaktywacji kinazy ERK.
- Wirować przy 20 000 x g przez 15 minut. Zebrać i przechowywać supernatant.
- Odsolić próbkę białka do 50 mM wodorowęglanu amonu za pomocą kolumny ze złożem wypełnionym żywicą G25 o pojemności 3,45 ml (1,3 x 2,6 cm), która jest odpowiednia dla próbki o objętości 1 ml.
- Uruchom 12% SDS-PAGE z 2,5 μl próbki białka, aby sprawdzić zarówno jej integralność, jak i wydajną fosforylację (ryc. 4).
- Liofilizuj ufosforylowaną próbkę Tau. Przechowywać proszek w temperaturze -20 °C.
4. Akwizycja widm NMR (Rysunek 5)
- Rozpuścić 4 mg liofilizowanego 15N, 13C ERK-fosforylowanego-Tau w 400 μl buforu NMR (50 mM NaPi lub 50 mM deuterowanego Tris-d11. Cl, pH 6,5, 30 mM NaCl, 2,5 mM EDTA i 1 mM DTT).
- Dodać 5% D2O do blokowania pola spektrometru NMR i 1 mM TMSP (sól sodowa kwasu 3-(trimetylosililo)propionowego-2,2,3,3-d4)) jako wewnętrznego odniesienia sygnału NMR. Dodać 10 μl 40-krotnego roztworu podstawowego kompletnego koktajlu inhibitorów proteazy.
- Przenieść próbkę do probówki NMR o średnicy 5 mm za pomocą elektronicznej strzykawki z długą igłą lub pipety Pasteura. Zamknąć rurkę NMR za pomocą tłoka. Usunąć wszelkie pęcherzyki powietrza uwięzione między tłokiem a cieczą poprzez ruchy tłoka.
- Umieść probówkę NMR w wirówce. Dostosuj jego pionowe położenie w wirówce za pomocą odpowiedniego miernika dla używanej głowicy sondy NMR, tak aby większość roztworu próbki znajdowała się wewnątrz cewki NMR.
- Uruchom przepływ powietrza: kliknij przycisk lift w oknie systemu sterowania magnesem. Ostrożnie umieść kołpak z rurką w strumieniu powietrza w górnej części otworu magnesu. Zatrzymaj przepływ powietrza (kliknij podnoszenie) i pozwól, aby rurka opadła na miejsce wewnątrz głowicy sondy w magnesie.
- Ustaw temperaturę na 25 °C (298 K).
- Wykonaj półautomatyczne dostrajanie i dopasowywanie głowicy sondy, aby zoptymalizować przenoszenie mocy. Wpisz atmm w wierszu poleceń.
- Zablokować częstotliwość spektrometru za pomocą sygnału D2O próbki zarejestrowanej na kanale deuteru. Kliknij kłódkę w oknie systemu sterowania magnesami.
- Rozpocznij procedurę podkładkowania, aby zoptymalizować jednorodność pola magnetycznego w położeniu próbki. Wpisz topshim gui w wierszu poleceń, aby otworzyć okno podkładki. Kliknij przycisk Start w oknie podkładki. Sprawdź resztkową wartość odchylenia standardu B0, aby upewnić się, że podkładki regulacyjne są optymalne (mniej niż 2 Hz jest dobre).
- Skalibruj parametr p1 (długość impulsu o częstotliwości radiowej protonu w μs), który jest niezbędny do uzyskania rotacji spinów protonów o 90°. Celuj w impuls 360° za pomocą widma 1D protonów wodnych (ryc. 6).
- Dostosuj przesunięcie częstotliwości, ustawiając parametr o1 (w Hz) na częstotliwość wody protonowej w widmie 1D (rysunek 6).
- Rozpocznij akwizycję widma protonów 1D (sekwencja impulsów z sekwencją watergate do tłumienia sygnału wodnego, na przykład zggpw5) w celu weryfikacji sygnałów z próbki (rysunek 7). Dostosuj liczbę skanów do względnego stężenia białka. Wpisz zg w wierszu polecenia, aby rozpocząć pobieranie.
