1. Stężenie robocze składników reakcji
- Przygotować stężenia robocze do CD na świeżo i przechowywać je w temperaturze 4 °C przed rozpoczęciem reakcji.
nuta: Dla opisanych w pracy reakcji CD stężenia robocze składników są następujące: Bufor fosforanu sodu (pH 7,0) 1 mM, ATP 2 mM, DNA 500 nM, Białko 1 μM, MgCl2 10 mM, EDTA 50 mM, ADAADiN 5 μM.
2. Wybór i przygotowanie kuwet CD
- Zbieraj widma CD w przezroczystych kuwetach kwarcowych. Używaj kuwet prostokątnych lub cylindrycznych.
nuta: Do wszystkich reakcji opisanych w pracy użyto kuwety kwarcowej CD (objętość nominalna 0,4 ml, długość drogi 1 mm).
- Użyj roztworu do czyszczenia kuwety, aby wyczyścić kuwetę. Dodać 1% roztwór do czyszczenia kuwety w wodzie, aby uzyskać 400 μl roztworu, wlać go do kuwety i inkubować w temperaturze 37 °C przez 1 godzinę.
- Umyj kuwetę kilkakrotnie wodą, aby ją wyczyścić. Wykonaj skan wody lub bufora w kuwecie, aby sprawdzić, czy jest czysta.
nuta: Woda lub bufor muszą dawać odczyt w zakresie od 0 do 1 mdeg.
3. Przygotowanie białek i oligonukleotydów DNA
- Utrzymuj objętość białka poniżej 50 μl w reakcji, aby zminimalizować ilości składników buforowych, które czasami powodują powstawanie niejednoznacznych pików. Utrzymuj białko na lodzie przez cały czas trwania eksperymentu, aby uniknąć degradacji.
- Używaj oligonukleotydów DNA oczyszczonych przez PAGE w reakcjach.
nuta: W opisanych tu reakcjach DNA wykorzystano zarówno w formie natywnej, jak i chłodzonej termicznie (szybko chłodzonej (FC) i wolno chłodzonej (SC)). Szybkie chłodzenie sprzyja wiązaniom wewnątrzcząsteczkowym w DNA, dając więcej struktur drugorzędowych. W przeciwieństwie do tego, powolne chłodzenie sprzyja wiązaniom międzycząsteczkowym w DNA, co skutkuje mniejszą liczbą struktur drugorzędowych.
- W celu szybkiego schłodzenia należy podgrzać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 minuty na bloku grzewczym i natychmiast schłodzić je na lodzie. W przypadku powolnego chłodzenia należy ogrzewać DNA w temperaturze 94 °C przez 3 minuty i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej z szybkością 1 °C na minutę.
4. Ustawianie eksperymentów kontrolnych do rejestrowania widm linii bazowej
- Utrzymuj objętość reakcji na poziomie 300 μl we wszystkich reakcjach. Ustaw łącznie 5 reakcji wyjściowych w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml, jedna po drugiej, w następujący sposób: i) Bufor + Woda; ii) Bufor + MgCl2 + ATP + Woda; iii) Bufor + MgCl2 + ATP + Białko + Woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) Bufor + Białko + Woda.
5. Konfiguracja eksperymentów do nagrywania widm płyt CD
- Ustaw w sumie 5 reakcji, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych o pojemności 1,5 ml w następujący sposób: i) Bufor + DNA + Woda; ii) Bufor + DNA + MgCl2 + ATP + Woda; iii) Bufor + DNA + MgCl2 + ATP + Białko + Woda; iv) iii + EDTA lub ADAADiN; v) Bufor + DNA + Białko + Woda.
6. Skanowanie nagrań
- Włącz gaz i włącz spektrometr CD.
- Włączyć lampę po 10-15 minutach. Włączyć łaźnię wodną i ustawić temperaturę oprawki na 37 °C.
- Otwórz oprogramowanie CD spectrum.
- Ustaw temperaturę na 37 °C.
- Ustaw zakres długości fali na 180 - 300 nm.
- Ustaw czas na punkt na 0,5 s.
- Ustaw numer skanowania na 5.
- Kliknij Pro-Data Viewer, utwórz nowy plik i zmień jego nazwę, podając szczegółowe informacje o eksperymencie i dacie.
- Utrzymuj wszystkie składniki reakcyjne na lodzie, aby uniknąć degradacji. Przygotować linie podstawowe i reakcje, jedna po drugiej, w probówkach wirówkowych i wymieszać je przez pipetowanie. Ostrożnie przenieś mieszaninę reakcyjną do kuwety, upewniając się, że nie ma pęcherzyków powietrza.
- W przypadku przeprowadzania eksperymentu w czasie, należy inkubować reakcje w temperaturze 37 °C przez wymagany czas i wykonać skanowanie. Dodaj EDTA do buforu zawierającego DNA, ATP, Mg+2 i białko, aby zatrzymać hydrolizę ATP.
- Zwiększ stężenie EDTA i czas jego inkubacji, aby całkowicie zahamować aktywność ATPazy.
- Odejmij linie podstawowe od odpowiednich reakcji w oprogramowaniu (np. odejmij reakcję 1 od linii podstawowej 1). Wygładź dane w oprogramowaniu widma CD lub w oprogramowaniu do tworzenia wykresów danych. Wykreśl dane w oprogramowaniu do drukowania danych.
nuta: Odjęcie linii podstawowych od odpowiednich reakcji da widma netto CD tylko DNA.
7. Analiza i interpretacja danych
- Użyj wzoru podanego przez równanie (1), aby przeliczyć wartości uzyskane w milistopniach na średnią eliptyczność pozostałości.
Tutaj S to sygnał CD w milistopniach, c to stężenie DNA w mg / ml, mRw to średnia masa pozostałości, a l to długość drogi w cm.
- Narysuj wykres w odniesieniu do długości fali i średniej eliptyczności pozostałości za pomocą oprogramowania do wykreślania danych i przeanalizuj piki.
- Aby wykreślić wykres, wybierz średnią eliptyczność pozostałości na osi Y i długość fali na osi X i wykreśl wykres prostoliniowy.
nuta: Ten wykres dostarczy charakterystycznych pików różnych form DNA. Formy DNA odpowiadające pikom można zidentyfikować na podstawie istniejącej literatury.