$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Przygotowanie sond UV-Vis/Raman
- Przygotuj czysty roztwór AuNP
- Przygotować 2 ml roztworu AuNPs o stężeniu około 1 x 1011 cząstek na ml.
- Jeżeli konieczne jest zagęszczenie AuNPs, należy napełnić probówki wirówkowe o niskiej mocy wiązania 2 000 μl wyjściowego AuNP i odwirować przy 5 000 x g przez 20 minut lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Usunąć supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć osadu AuNP.
- Połączyć pozostałe roztwory AuNP w jednej probówce i oszacować stężenie, uzyskując pomiar UV-Vis i porównując wartości ze znanymi stężeniami, ponieważ jest to zależność liniowa.
- Określ odpowiedni współczynnik etykietowania reportera Ramana
- Przygotować roztwór roboczy reportera Ramana rozpuszczonego w metanolu. Stężenie to będzie zależało od użytego reportera. W tej pracy należy przygotować jodek 3,3′-dietylotiotrikarbocyjaniny (DTTC) w roztworze roboczym 200 μM.
- Zakładając końcową objętość 100 μl dla każdej studzienki, dodaj wystarczającą ilość roboczego roztworu reporterowego do każdej studzienki w pierwszym rzędzie 96-dołkowej płytki, tak aby reporter Ramana miał stężenia od 0,2 μM do 10 μM. Do każdej studzienki dodać tyle wody klasy HPLC, aby objętość wynosiła 80 μl. Dodać 20 μl AuNP do każdej studzienki, tworząc ostateczną objętość 100 μl dla każdej studzienki. Przykład znajduje się w tabeli 1.
- Zmierz widma UV-Vis od 400 do 700 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis z odczytem płytkowym. Odpowiednie stężenie to najwyższe stężenie o zdefiniowanych pikach dla widm UV-Vis. Powtórzyć krok 2.2.2 przy rosnących stężeniach, aż do uzyskania najwyższego stosunku stężeń reporterów Ramana do AuNPs.
nuta: Barwnik oraz kształt, wielkość i producent AuNP mają wpływ na odpowiednie stężenie. Dlatego wymienione kroki muszą być oceniane i zmieniane w zależności od użytych komponentów. Protokół ten polegał na użyciu dodatnio naładowanego barwnika. W związku z tym wiązanie między AuNP a reporterem zostało poprawione dzięki zastosowaniu ujemnie naładowanych AuNP. Dokonano tego za pomocą AuNP zwieńczonych cytrynianem. Więcej informacji można znaleźć w sekcji Dyskusja.
- Powiązanie ramanowskiego reportera i PEG-Ab z AuNP
- Przygotować dwie partie po 1,5 ml AuNP i reportera Ramana w uprzednio ustalonym stężeniu, pozwalając reporterowi Ramana związać się z AuNP przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
- Dodać przeciwciało pegylowane (PEG-Ab) do jednej partii roztworu reporterowego AuNP i Ramana, aby uzyskać stosunek przeciwciał do cząstek 200:1. To rozwiązanie będzie dotyczyło próbek testowych. W oddzielnej probówce do mikrowirówki dodać pegylowany antygen do drugiej partii AuNP i roztworu reporterowego Ramana w stosunku 200:1 przeciwciała do cząstek, które mają być użyte jako kontrola. Roztwory inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej.
UWAGA: Stosunek przeciwciał do cząstek będzie specyficzny dla użytych AuNP i barwnika i powinien być zoptymalizowany dla każdego indywidualnego przypadku. Celem jest uzyskanie najwyższego stosunku przeciwciał, z którymi mogą wiązać się sondy AuNP, przy jednoczesnym zapobieganiu agregacji cząstek. Użyj poniższego równania, aby określić odpowiednie woluminy do zsumowania:
gdzie V jest objętością, a C jest stężeniem wyrażonym w cząstkach lub przeciwciałach na ml. Ostateczna objętość powinna wynosić około 1,5 ml.
- Zablokuj pozostałe miejsca na powierzchni AuNP za pomocą mPEG-SH.
- Przygotować mPEG-SH rozpuszczając stały tiol glikolu metoksypolietylenowego do stężenia 200 μM przy użyciu wody. Wirować roztwór, aż mPEG-SH całkowicie się rozpuści.
- Dodaj mPEG-SH w stosunku 40 000:1 do roztworu AuNP-PEG-Ab wykonanego w kroku 2.3. Inkubować roztwór w temperaturze pokojowej przez 10 minut, aby upewnić się, że pozostałe miejsca na nanocząsteczce złota są zablokowane. Użyj poniższego równania, aby określić odpowiednie woluminy do zsumowania:
gdzie V jest objętością, a C jest stężeniem wyrażonym w cząstkach lub przeciwciałach na ml. Ostateczna objętość powinna wynosić około 1,5 ml.
- Odzyskiwanie funkcjonalnych sond Ramana.
- Odwirować cząstki o masie 5 000 x g przez 20 minut w probówkach wirówkowych o niskim poziomie wiązania lub do momentu, gdy supernatant będzie klarowny. Usunąć supernatant przez pipetowanie, uważając, aby nie naruszyć AuNPs.
- Ponownie zawiesić cząstki w 1 ml roztworu 1x PBS, który został wcześniej przygotowany. Oszacować stężenie AuNP, wykonując pomiar UV-Vis małej objętości roztworu (3 μl) i porównać wyniki z pomiarami znanego stężenia AuNP. Dostosuj objętość tak, aby końcowy roztwór wynosił co najmniej 1 x 1011 cząstek na ml.
- Roztwory należy przechowywać w temperaturze 4 °C do czasu, gdy zostaną wykorzystane do funkcjonalizacji płytki do testu immunologicznego. Roztwory należy zużyć w ciągu tygodnia.
Tabela 1. Przykład rozcieńczenia DTTC. Różne rozcieńczenia DTTC i związane z nimi objętości zapasowego DTTC, roztworu nanocząstek złota i wody.
pkt.
pkt.
pkt.
pkt.
Rozdział
pkt.
pkt.
Rozdział
| Objętości do dodania każdego składnika (ml) |
| Stężenie końcowe DTTC (mM) | Roztwór roboczy DTTC (200 mM) | AuNP | Woda |
| 0,2 | 0,1 | 20 | 79,9 |
| 0,6 | 0,3 | 20 | 79,7 |
| 1 | 0,5 | 20 | 79,5 |
| cyfra arabska | 1,0 | 20 | 79 |
| 5 | Rozdział 2.5 | 20 | 77,5 |
| 7 | 3,5 | 20 | 76,5 |
| 10 | 5.0 | 20 | 75 |
2. Przygotowanie płytki do testów immunologicznych
- Zwiąż żądany antygen z płytką testu immunologicznego.
- Przygotować wystarczającą ilość rozcieńczonych antygenów (50 μg/ml), aby wypełnić studzienki styropianowe. Zwiruj roztwór i natychmiast dodaj roztwór do dołków płytkowych. Pozostawić antygen do związania się z płytkami przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej.
- Zmyć niezwiązane antygeny.
- Usunąć nadmiar roztworu antygenu, wrzucając roztwór do pojemnika na odpady i uderzając talerzem o blat pokryty ręcznikiem papierowym.
- Dodaj TBST do studzienek, aby umyć powierzchnię, a następnie usuń pranie w taki sam sposób, jak opisano wcześniej. Powtórz ten krok jeszcze dwa razy.
- Zablokuj pozostałe miejsca wiązania na płycie, aby zapobiec niespecyficznemu wiązaniu.
- Dodać 70 μl roztworu blokującego HSA do każdego dołka płytki i inkubować w temperaturze pokojowej przez 30 minut.
- Wyjąć i wypłukać płytkę, stosując tę samą procedurę, która została opisana w kroku 3.2. Przykryj płytkę i przechowuj w suchym miejscu w temperaturze 4 °C do momentu przygotowania do dalszego użycia.
- Funkcjonalizować płytkę do testu immunologicznego.
- Dodać 70 μl nanocząstek sondy przygotowanych w sekcji 2 do pierwszej kolumny płytki 96-dołkowej i rozcieńczyć kolejne kolumny przy użyciu seryjnego rozcieńczenia 1:2. Pozostawić płytkę do inkubacji przez co najmniej 1 godzinę. Przykład przygotowania płytki do testu immunologicznego przedstawiono na rysunku 1.
- Umyj płytkę TBST pięć razy, jak opisano w kroku 3.2, upewniając się, że AuNP zostały odpowiednio zutylizowane. Po ostatnim płukaniu dodaj 70 μl 1x PBS do każdej studzienki i przykryj uszczelką płytkową.
UWAGA: Próbki kontrolne powinny być czyste. Jeśli wystąpiło niespecyficzne wiązanie, próbki kontrolne będą miały podobny kolor jak próbki testowe.
- Czułość testu za pomocą spektroskopii UV-Vis i Ramana.
- Dla każdej studzienki zmierz widma UV-Vis w zakresie od 400 do 700 nm za pomocą spektrofotometru UV-Vis z odczytem płytki.
- Używając odwróconego mikroskopu Ramanowskiego, skieruj obiektyw na powierzchnię studni, w której znajdują się sondy AuNP. Uzyskaj widma ramanowskie studni. Zbierz widmo w zakresie od 1,800 cm-1 do 400 cm-1. Powtórz ten krok dla wszystkich studzienek.
- Korzystając z odpowiedniego oprogramowania spektralnego, wykonaj korekcję wielomianu 11rzędu dla widm Ramana i wielomianu 3rzędu dla widm UV-Vis.
- Za pomocą odpowiedniego oprogramowania spektralnego znormalizuj widma Ramana i UV-Vis. Ustaw wartość maksymalną na 1 i odpowiednio przeskaluj wszystkie inne wartości. Aby znormalizować widma Ramana, wybierz unikalny pik polistyrenu i ustaw go na wartość 1, a następnie odpowiednio przeskaluj wszystkie inne wartości.
- Korzystając z odpowiedniego oprogramowania spektralnego, wykonaj całkowanie pików dla każdego widma. W przypadku widm Ramana pik reprezentujący reportera Ramana musi znajdować się w obszarze, w którym nie ma pików polistyrenu. Aby przeprowadzić całkowanie pików, należy określić całkujące granice dla żądanego piku i zapisać żądany obszar piku dla wszystkich próbek, w tym dla próbek.
- Wykreślić średni obszar zainteresowania piku w funkcji logarytmu stężenia AuNP ze słupkami błędu dla każdego punktu wskazującymi związane z nim odchylenie standardowe. Dopasuj te punkty kalibracji do 4-parametrowej krzywej logistycznej.
- Określić średnią wartość próby ślepej, uśredniając powierzchnię piku będącego przedmiotem zainteresowania dla próbki zerowej. Określ odchylenie standardowe tych obszarów; Jest to odchylenie standardowe ślepej próby.
- Dla tego samego piku analizowanego w poprzednim kroku znajdź odchylenie standardowe tego obszaru piku dla najniższego stężenia.
- Obliczyć granicę ślepej próby i dolną granicę wykrywalności, jak określono w sekcji Reprezentatywne wyniki. Użyj tych wartości z krzywymi kalibracyjnymi 4PL, aby określić LLOD pod względem stężenia AuNP
.
