Method Article

Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

DOI:

10.3791/3064

⸱

May 11th, 2012

1Microbiology, Immunology, and Molecular Genetics, University of California, Los Angeles

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Mikroorganizmy są obecne na wszystkich powierzchniach nieożywionych, tworząc wszechobecne źródła możliwego skażenia w laboratorium. Sukces eksperymentu zależy od zdolności naukowca do sterylizacji powierzchni roboczych i sprzętu, a także zapobiegania kontaktowi sterylnych narzędzi i roztworów z powierzchniami niesterylnymi. W tym miejscu przedstawiamy etapy kilku metod posiewu rutynowo stosowanych w laboratorium do izolacji, rozmnażania lub liczenia mikroorganizmów, takich jak bakterie i fagi. Wszystkie pięć metod obejmuje technikę aseptyczną, czyli procedury, które utrzymują sterylność materiałów eksperymentalnych. Opisane procedury obejmują (1) powlekanie smugami kultur bakteryjnych w celu wyizolowania pojedynczych kolonii, (2) posiewanie i (3) posiewanie w celu wyliczenia żywotnych kolonii bakteryjnych, (4) miękkie nakładki agarowe w celu wyizolowania faga i zliczenia blaszek oraz (5) posiewanie replik w celu przeniesienia komórek z jednej płytki na drugą w identycznym wzorze przestrzennym. Procedury te mogą być wykonywane na stanowisku laboratoryjnym, pod warunkiem, że obejmują niepatogenne szczepy mikroorganizmów (poziom bezpieczeństwa biologicznego 1, BSL-1). W przypadku pracy z organizmami BSL-2 manipulacje te muszą odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zapoznaj się z aktualnym wydaniem Raportu o bezpieczeństwie biologicznym w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) oraz z kartami charakterystyki substancji zakaźnych (MSDS) dla substancji zakaźnych, aby określić klasyfikację zagrożenia biologicznego, a także środki ostrożności i urządzenia zabezpieczające wymagane dla danego mikroorganizmu. Szczepy bakteryjne i zapasy fagów można uzyskać od badaczy, firm i kolekcji utrzymywanych przez określone organizacje, takie jak American Type Culture Collection (ATCC). Zaleca się stosowanie szczepów niepatogennych podczas nauki różnych metod posiewu. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym protokole, uczniowie powinni być w stanie:

● Wykonuj procedury galwaniczne bez zanieczyszczania mediów.
● Izolować pojedyncze kolonie bakteryjne metodą powlekania smugowego.
● Stosuj metody powlekania i rozsiewania w celu określenia stężenia bakterii.
● Wykonuj miękkie nakładki agarowe podczas pracy z phage.
● Przenieś komórki bakteryjne z jednej płytki na drugą za pomocą procedury posiewu repliki.
● Biorąc pod uwagę zadanie eksperymentalne, wybierz odpowiednią metodę powlekania.

Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Prepare a Safe and Sterile Workspace

  1. Bądź zaznajomiony ze wszystkimi zasadami laboratoryjnymi i środkami ostrożności w zakresie bezpieczeństwa, które należy przestrzegać podczas pracy z mikroorganizmami. Niezależnie od klasyfikacji zagrożenia biologicznego, wszystkie materiały, które mają kontakt z mikroorganizmami, są uważane za zakaźne odpady i muszą być dezaktywowane przed wyeliminowaniem. Przestrzegaj wytycznych dotyczących bezpieczeństwa zgodnie z tymi, które są zapewniane przez instytucjonalne wydziały zdrowia i bezpieczeństwa środowiska, ustanawiając odpowiednie pojemniki na odpady do natychmiastowego i odpowiedniego wyeliminowania potencjalnie skażonych materiałów (zagrożenia biologiczne).
  2. Wysterylizuj wszystkie narzędzia, roztwory i media przed ich użyciem do procedur okładania.
  3. Wyczyść wszystkie materiały, które zaśmiecają Twoje miejsce pracy na ławce laboratoryjnej.
  4. Wyczyść miejsce pracy z dezynfektorem, aby zminimalizować możliwe zanieczyszczenie.
  5. Ustaw palnik Bunsena i pracuj powoli, ostrożnie i celowo w obrębie sterylnego obszaru pola stworzonego przez wspinający się płomień.
    • Jeśli pracujesz z organizmami BSL-2, ustaw swój obszar pracy w szafie biobezpieczeństwa. Palnik Bunsena nie może być używany wewnątrz szafy, ponieważ ciepło z płomienia zakłóca przepływ powietrza niezbędny do jego funkcjonowania.
  6. Ułóż wszystkie zasoby potrzebne do procedury na ławce laboratoryjnej w pobliżu sterylnego pola. Upewnij się, że wszystkie materiały są odpowiednio oznakowane. Zorganizowanie obszaru roboczego w celu maksymalizacji wydajności pracy i uniknięcia niepotrzebnych ruchów zminimalizuje czas ekspozycji materiałów eksperymentalnych na skażone powietrze.
    • Umieść palnik Bunsena po prawej stronie na ławce.
    • Umieść agarowe płytki lub naczynia Petriego po lewej stronie.
    • Ułóż kultury komórkowe, rurki, kolby i butelki na środku ławki.
    • Poluzuj czapki rurek, kolb i butelek, aby można je było łatwo otworzyć jedną ręką podczas późniejszych manipulacji.
  7. Dokładnie umyj ręce z odkażającą mydłem i ciepłą wodą przed manipulowaniem mikroorganizmami.

2. Procedura okładania płyt: Izolowanie kolonii bakterii metodą czworoboczną

Procedura okładania płyt służy do odizolowania czystych kultur bakterii, lub kolonii, z mieszanych populacji poprzez prostą mechaniczną separację. Pojedyncze kolonie składają się z milionów komórek rosnących w klastrach na lub wewnątrz płytki agarowej (Rysunek 1). Kolonia, w przeciwieństwie do pojedynczej komórki, jest widoczna gołym okiem. W teorii, wszystkie komórki w kolonii są pochodzenia od jednego bakterii początkowo zdeponowanego na płytce i są więc nazywane klonem, lub klastrem genetycznie identycznych komórek.

  • Bakteria istnieją w różnych kształtach i rozmiarach. Na przykład, pojedyncze komórki Escherichia coli mają kształt pręcikowaty o średniej długości 2 μm i szerokości 0,5 μm, podczas gdy komórki Streptococcus mają kształt kulisty o średnicy 1 μm. Niektóre bakterie (takie jak E. coli) istnieją jako pojedyncze komórki, podczas gdy inne tworzą wyraźne wzorce skojarzeń. Streptococcus, na przykład, rośnie w parach lub formują łańcuchy lub klastery komórek. Ogólnie przyjmuje się, że pojedyncza kolonia powstaje z jednej komórki przechodzącej podział binarny; jednak ta założenie nie jest prawdziwe dla tych bakterii, które naturalnie istnieją jako pary, łańcuchy, lub klastery, lub które dzielą się za pomocą innych mechanizmów. Alternatywnie, jeśli zbyt wiele bakterii jest okładanych, wówczas może wystąpić nakładanie się komórek i zwiększyć prawdopodobieństwo, że dwie lub więcej bakterii da początek temu, co wygląda na pojedynczą kolonię. Aby uniknąć tych komplikacji przy opisywaniu lub liczeniu kultur bakterii rosnących na stałym podłożu, kolonie są nazywane jednostkami tworzącymi kolonie (cfu).

Przy użyciu procedury okładania płyt, mieszanina komórek jest rozprowadzana na powierzchni pół-stałe, agarowe, pożywki w naczyniu Petriego, tak aby coraz mniej komórek bakterii było osadzonych w szeroko rozstawionych punktach na powierzchni pożywki i, po inkubacji, rozwijały się w kolonie. Metoda czworoboczna do izolowania pojedynczych kolonii z mieszaniny komórek zostanie opisana tutaj.

  1. Okładanie płyt można wykonać za pomocą wielu różnych instrumentów (Rysunek 2). Pętla metalowa może być wielokrotnie ponownie używana i jest wykorzystywana do okładania rutynowych szczepów laboratoryjnych. Jednorazowe plastikowe pętle są dostępne komercyjnie i są częściej używane podczas pracy ze szczepami BSL-2 w szafie biobezpieczeństwa. Wielu naukowców woli używać jednorazowych, wstępnie sterylnych drewnianych patyczków lub płaskich sztyftów do okładania płyt. Są to niedroga alternatywa dla jednorazowych plastikowych pętli i mogą być szczególnie przydatne podczas pracy z próbkami ś

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Hodowla mikroorganizmów obejmuje szereg metod posiewu, z których wszystkie wymagają zachowania techniki aseptyki podczas manipulacji komórkami i pożywkami. W protokole tym opisano pięć różnych procedur. Chociaż te techniki powlekania są rutynowo stosowane do manipulowania bakteriami i fagami, można je również stosować do hodowli komórek ssaków i mikroorganizmów eukariotycznych powszechnie stosowanych w genetyce molekularnej, takich jak drożdże (tj. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), glony i pierwotniaki (tj. Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) oraz nicienie (tj. Caenorhabditis elegans). Istnieją również liczne (i jeszcze bardziej wyrafinowane) warianty każdej metody posiewu, w zależności od celu eksperymentalnego lub badanego organizmu. Dlatego ważne jest, aby nie tylko wybrać najbardziej odpowiednią technikę dla danego eksperymentu lub docelowego mikroorganizmu, ale także dostosować metodologię tak, aby wyniki eksperymentu odpowiednio odpowiadały na pytanie lub problem badawczy.

Niektóre z najnowszych zastosowań technik powlekania omówionych w tym protokole obejmują postęp technologiczny, który zapewnia wyniki o wysokiej przepustowości w badaniach przesiewowych i eksperymentach związanych z odkrywaniem leków. Na przykład centra sekwencjonowania genomu wykorzystują "metodę Copacabana" do rozprzestrzeniania bibliotek klonów, które są komórkami E. coli przekształconymi plazmidami zawierającymi fragmenty DNA pochodzące z genomu mikroorganizmu. Ponieważ jednorazowo przygotowywane są dziesiątki dużych płytek (zwanych tacami do testów biologicznych), do wytrząsania szklanych kulek dla całej partii tacek używa się automatycznej wytrząsarki do płytek. Ponadto, podczas selekcji kolonii z tych płytek po inkubacji, do zbierania komórek z odpowiednich kolonii jako inokulum dla bulionu LB w 384-dołkowych mikropłytkach używa się robotycznego zbieracza kolonii. W przypadku tego wysokoprzepustowego testu przesiewowego zastosowanie mają zasady proceduralne techniki płytki rozsiewającej, ale technologia pozwala na automatyzację i skalowanie różnych etapów, aby umożliwić jednoczesną analizę dużej liczby próbek w krótkim czasie.

Firmy biotechnologiczne i farmaceutyczne inwestują znaczne środki w rozwój wysokoprzepustowej technologii dla najbardziej podstawowych technik w mikrobiologii i genetyce molekularnej. Na przykład istnieją wielokanałowe mikropipetory do przenoszenia objętości do 8 lub 12 próbek jednocześnie. Istnieją nawet zrobotyzowane stacje robocze, które manewrują 96-kanałową głowicą pipetową! Wysiłki te obejmują multidyscyplinarne zespoły naukowców, łączące biologów posiadających wiedzę metodologiczną z inżynierami i programistami komputerowymi, którzy mogą opracować oprzyrządowanie potrzebne do wykonywania operacji mechanicznych związanych z eksperymentami. Niezależnie od zastosowania badawczego, cel wspólny dla firm rozwijających te technologie jest taki sam – automatyzacja procesów laboratoryjnych, narzędzi, systemów i przyrządów, czyniąc je mniej pracochłonnymi i bardziej wydajnymi.

Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nie mam nic do ujawnienia.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Specjalne podziękowania dla Cori Sanders z Iroc Designs za przygotowanie ilustracji oraz dla Krisa Reddiego i Bhairava Shaha z UCLA za przygotowanie próbek kultur i pomoc przy rysunkach. Finansowanie tego projektu zostało zapewnione przez HHMI (HHMI Grant No. 52006944).

Materials

Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4°C.

Jeśli przygotowujesz probówki do procedury nalewania, pozwól agarowi ostygnąć do ~55° C, następnie dodać 2,0 ml cykloheksymidu o stężeniu 50 mg/ml. W asepcie dozować 18,0 ml stopionego agaru na probówkę o średnicy 18 mm, a następnie przechowywać w temperaturze 4 stopni Celsjusza. Agar zestala się i przed użyciem należy go stopić w parowarze lub kuchence mikrofalowej.

2. Minimalna zawartość soli agaru (MSA) + 0,1% (w/v) źródło węgla

< treść>

Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4°C.

* Źródła węgla użyte w eksperymentach przedstawionych na rysunku 13 obejmują acetamid, laktozę i glicynę.

** Roztwór soli śladowych przygotowuje się w 0,1 N HCl w następujący sposób. Dodaje się go do bazy przed sterylizacją (autoklaw w temperaturze 121& C przez 20 minut).

< treść>

3. Miękki agar EHA (0,65 % w/v)

< treść>

Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4°C.

4. Twardy agar EHA (1,2% w/v)

< treść>

Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4°C.

5. 1X Middlebrook Top Agar (miękki agar MBTA, 0,5% w/v)

< treść>

Rozpuść 50 ml 2XTA i pozwól mu ostygnąć do ~55°C. Stosując technikę aseptyczną, dodaj CaCl2 i 7H9 bulion do stopionego agaru. Aseptycznie dozować 4,5 ml mieszaniny na probówkę 13 mm i przechowywać w temperaturze 55° Inkubator C ≤ 7 dni. Chłodzenie MBTA do temperatury pokojowej lub 4° C spowoduje, że CaCl2 wytrąci się z roztworu.

* 100 mM CaCl2. Zapas musi być przechowywany w temperaturze pokojowej, aby zapobiec wytrącaniu się CaCl2 z roztworu.

** 7H9 medium płynne: Neat

< treść>

Wymieszaj bazę z wodą, a następnie dodaj glicerol, mieszając. Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Przechowywać w temperaturze 4°C.

*** 2X Middlebrook Top Agar (2XTA, 1,0% w/v)

< treść>

Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Dozować 50 ml porcji do butelek o pojemności 100 ml i przechowywać w temperaturze 4&st;C.

6. Płytki agarowe Middlebrook 7H10 (twardy agar MHA, 1,9% w/v)

< treść>

Wymieszaj bazę agarową z wodą, a następnie dodaj glicerol, mieszając. Podgrzej roztwór do wrzenia, a następnie mieszaj przez minutę, aby całkowicie rozpuścić proszek bazowy. Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Pozwól agarowi ostygnąć do ~55° Następnie w asepcie dodać następujące odczynniki:

< treść>

* suplement AD

< treść>

Filtruj ten roztwór; Nie sterylizować w autoklawie. Przechowywać w temperaturze 4°C.

** Filtruj-sterylizuj i przechowuj te roztwory w temperaturze 4° C jak ≤ 60 dni.

7. Agar LB (1,5% w/v) + X-Gal (60 μ g/ml)

< treść>

Autoklaw pod kątem 121° C przez 20 minut w celu sterylizacji. Pozwól agarowi ostygnąć do ~55° C, następnie w asepcie dodać 3,0 ml roztworu X-Gal o stężeniu 20 mg/ml. Świeżo przygotować bulion X-gal, rozpuszczając 400 mg X-Gal w 20 ml dimetyloformamidu (DMF).

Tabela konkretnych odczynników:

< treść>

Tabela konkretnych urządzeń:

< treść>
List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments

1. Agar z tryptonem drożdżowym (YTA)

< treść>
Ekstrakt drożdżowy2.0 g
Trypton10.0 g
Agar
Woda destylowanado 1000,0 ml
pH 7,0
NH4Cl1.0 g
NH2HPO4• 2H2O2.14 g
KH2PO41,09 g
MgSO4• 7H2O0,2 g
Źródło węgla*1.0 g
Roztwór soli śladowych**10.0 ml
Agar
Woda destylowanado 1000,0 ml
pH 7,0
FeSO4• 7H2O300,0 mg
MnCl2• 4H2O180,0 mg
Co(NO3)2• 6H2O130,0 mg
ZnSO4.7H2O40,0 mg
H2MoO420,0 mg
CuSO4• 5H2O1,0 mg
CaCl21000,0 mg
HCl (0,1 N)do 1000,0 ml
Agar
Trypton13.0 g
NaCl8.0 g
Na Cytrynian&byk; 2H2O2.0 g
Glukoza
Woda destylowanado 1000,0 ml
Agar12.0 g
Trypton13.0 g
NaCl
Na Cytrynian&byk; 2H2O
Glukoza
Woda destylowanado 1000,0 ml
100 mM CaCl2 stock* 1 ml
7H9 płynne medium: Neat **50 ml
2XTA ***50 ml
7H9 baza bulionowa
40% zapasów glicerolu5 ml
Woda destylowanado 900,0 ml
7H9 baza bulionowa
Agar1.0 g
Woda destylowanado 1000.0 ml
7H10 baza agarowa
40% zapasów glicerolu12,5 ml
Woda destylowana887.5 ml
AD (wstępnie podgrzany do 37° C)*100 ml
50 mg/ml karbenicyliny **1,0 ml
10 mg/ml cykloheksymidu **1,0 ml
NaCl > 17 g >
Albumina (frakcja V)> 100 g>
Dekstroza (D-glukoza)> 40 g>
Woda destylowana> do 2000.0 ml>
Trypton10.0 g
Ekstrakt drożdżowy
NaCl10.0 g
Agar
Woda destylowanado 1000,0 ml
pH 7,5 przy 25° C
Nazwa odczynnikaCompanyNumer katalogowy
Ekstrakt drożdżowyBecton Dickenson212750
TryptonBecton Dickenson211705
AgarBecton Dickenson214030
NH4ClAcros Organics123340010
NH2HPO4• 2H2OSigma-Aldrich30435
KH2PO4Fisher NaukowyBP 303-500
MgSO4• 7H2OSigma-Aldrich230391
AcetamidSigma-Aldrich A-0500
LaktozaFisher Scientific L6-500
GlicynaSigma-AldrichG-7126
FeSO4• 7H2OSigma-AldrichF8048
MnCl2• 4H2OSigma-AldrichM-3634
Co(NO3)2• 6H2OSigma-Aldrich230375
ZnSO4.7H2OSigma-AldrichZ4750
H2MoO4Acros Organics213621000
CuSO4• 5H2OSigma-Aldrich209198
CaCl2Sigma-AldrichC1016
HClFisher NaukowyA144-212
CykloheksymidSigma038K1561
karbenicylinaCellgro46-100-RG
NaClFisherS271-1
Na Cytrynian&byk; 2H2OFisherS279-500
Glukoza (dekstroza)BD215530
7H9 baza bulionowaBD271310
7H10 baza agarowaBD262710
GlycerolSheltonIB15760
Albumina (frakcja V)FisherS71907
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranozyd) TeknovaX1205
dimetyloformamid (DMF)SigmaD4551
EtanolFisherCDA19
Wybielacz chlorowyChlorox02490/06644884
CiDecon (środek dezynfekujący)Decon Laboratories, Inc.8504
Nazwa sprzętuCompanyNumer katalogowyEksperyment
Metalowe pętleAmerykańskie produkty edukacyjneS17352Powłoka smugowa
Jednorazowe plastikowe pętleFisher22-363-602Powłoka smugowa
Drewniane kijeFisher23-400-104Powłoka smugowa
Wykałaczki płaskieAmerykańskie produkty edukacyjneS67859Powłoka smugowa
Stoły obrotoweFisher08-758QPowłoka rozsiewająca
pręty szklaneBellco GlassNC9004380Powłoka rozsiewająca
4 mmFisher11-312BPowłoka rozsiewająca
Aksamitna ściereczkaProdukty Bel-Art09-718-2Replika poszycia
Blok cylindrycznyProdukty Bel-Art09-718-1Replika poszycia
< g> 8,0 g Suplement Koraliki szklane

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Barker, K. At the Bench: A Laboratory Navigator. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (1998).
  2. US Department of Health and Human Services (DHHS). Biosafety in Microbiological And Biomedical Laboratories (BMBL). , 5th, U.S. Government Printing Office. Washington DC. Available from: http://www.cdc.gov/biosafety/publications/bmbl5/index.htm (2009).
  3. Dulbecco, R., Vogt, M. Some problems of animal virology as studied by the plaque technique. Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 18, 273-279 (1953).
  4. Fields, B. N., Knipe, D. M., Chanock, R. M., Hirsch, M. S., Melnick, J. L., Monath, T. P., Roizman, B. Fields Virology. 1, 2nd, Raven Press. New York, NY. (1991).
  5. Gilbert, R. A., Ouwerkerk, D., Zhang, L. H., Klieve, A. V. Cooperative Research Center for Beef Genetic Technologies. In vitro detection and primary cultivation of bacteria producing materials inhibitory to ruminal methanogens. Journal of Microbiological Methods. 80, 217-218 (2010).
  6. Jett, B. D., Hatter, K. L., Huycke, M. M., Gilmore, M. S. Simplified agar plate method for quantifying viable bacteria. BioTechniques. 23, 648-650 (1997).
  7. Karam, J. D. Molecular Biology of Bacteriophage T4. , ASM Press. Washington, DC. (1994).
  8. Knipe, D. M., Howley, P. M., Griffin, D. E., Lamb, R. A., Martin, M. A., Roizman, B., Straus, S. E. Fundamental Virology. , 4th, Lippincott, Williams, and Wilkins. Philadelphia, PA. (2001).
  9. Lederberg, J., Lederberg, E. M. Replica plating and indirect selection of bacterial mutants. J. Bacteriol. 63, 399-406 (1952).
  10. Miller, J. H. A Short Course in Bacterial Genetics: A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and related bacteria. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Plainview, NY. (1992).
  11. Mills, K. V., Gareau, J. R., Garcia, A. M. Low-cost modification to the Copacabana method for spreading transformation mixtures. BioTechniques. 39, 188(2005).
  12. Jordan, T., et al. RESEARCH: National Genomics Research Initiative Phage Resource Laboratory Manual. , Howard Hughes Medical Institute. (2008).
  13. Sambrook, J., Russell, D. W. Molecular Cloning - A Laboratory Manual. , 3rd, Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, New York. (2001).
  14. Sanders, E. R., Miller, J. H. I. Microbiologist: A Discovery-based Course in Microbial Ecology and Molecular Evolution. , ASM Press. Washington, DC. (2010).
  15. Slonczewski, J. L., Foster, J. W. Microbiology - An Evolving Science. , 2nd, W.W. Norton & Co., Inc. New York, NY. (2011).
  16. Teather, R. M., Wood, P. J. Use of Congo Red-Polysaccharide Interactions in Enumeration and Characterization of Cellulolytic Bacteria from the Bovine Rumen. Applied and Environmental Microbiology. 43, 777-780 (1982).
  17. Wise, K. Preparing Spread Plates Protocols. , Available from: http://www.microbelibrary.org/index.php/component/resource/laboratory-test/3085-preparing-spread-plates-protocols (2006).
  18. Worthington, M., Luo, R. Q., Pelo, J. Copacabana method for spreading E. coli and yeast colonies. BioTechniques. 30, 738-742 (2001).
  19. American Type Culture Collection (ATCC). , Available from: http://www.atcc.org/ (2012).
  20. EPA Microbiology Home Page. , Available from: http://www.epa.gov/nerlcwww/index.html (2012).
  21. The GENE Project: Laboratory Methods and Materials. , Available from: http://www.phys.ksu.edu/gene/g1.html (2012).
  22. Joint Genome Institute (JGI) Genome Sequencing Protocols: Library Plating Protocol. , Available from: http://www.jgi.doe.gov/sequencing/protocols/prots_production.html (2012).
  23. Microbial Genetics (maintained by Stanley Maloy at UCSD). , Available from: http://www.sci.sdsu.edu/~smaloy/MicrobialGenetics (2012).
  24. Organization of American States (OAS) Department of Sustainable Development (DSD). , Available from: http://www.oas.org/DSD/publications/Unit/oea59e/ch26.htm (2012).
  25. Public Health Agency of Canada: Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances. , Available from: http://www.phac-aspc.gc.ca/msds-ftss (2012).
  26. United States Environmental Protection Agency (EPA) Office of Water. , Available from: http://water.epa.gov (2012).
  27. American Society for Microbiology (ASM)'s Curriculum Recommendations Microbiology Majors Program. , Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-microbiology-majors-program.html (2012).
  28. Introductory Course in Microbiology. , Available from: http://www.asm.org/asm/index.php/unknown/asm-s-curriculum-recommendations-introductory-course-in-microbiology.html (2012).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Tags

Aseptic TechniquePlating MethodsStreak PlatePour PlateSpread PlateSoft Agar OverlayReplica PlatingBacterial ColoniesPhage PlaquesLaboratory Sterilization

Related Articles