Aseptyczne techniki laboratoryjne: metody galwanizacji

Podsumowanie

Podczas pracy z pożywkami i odczynnikami używanymi do hodowli mikroorganizmów, należy stosować technikę aseptyczną, aby zminimalizować zanieczyszczenie. Do izolacji, namnażania lub oznaczania liczby bakterii i fagów rutynowo stosuje się różne metody posiewu, z których wszystkie obejmują procedury utrzymujące sterylność materiałów eksperymentalnych.

Streszczenie

Mikroorganizmy są obecne na wszystkich powierzchniach nieożywionych, tworząc wszechobecne źródła możliwego skażenia w laboratorium. Sukces eksperymentu zależy od zdolności naukowca do sterylizacji powierzchni roboczych i sprzętu, a także zapobiegania kontaktowi sterylnych narzędzi i roztworów z powierzchniami niesterylnymi. W tym miejscu przedstawiamy etapy kilku metod posiewu rutynowo stosowanych w laboratorium do izolacji, rozmnażania lub liczenia mikroorganizmów, takich jak bakterie i fagi. Wszystkie pięć metod obejmuje technikę aseptyczną, czyli procedury, które utrzymują sterylność materiałów eksperymentalnych. Opisane procedury obejmują (1) powlekanie smugami kultur bakteryjnych w celu wyizolowania pojedynczych kolonii, (2) posiewanie i (3) posiewanie w celu wyliczenia żywotnych kolonii bakteryjnych, (4) miękkie nakładki agarowe w celu wyizolowania faga i zliczenia blaszek oraz (5) posiewanie replik w celu przeniesienia komórek z jednej płytki na drugą w identycznym wzorze przestrzennym. Procedury te mogą być wykonywane na stanowisku laboratoryjnym, pod warunkiem, że obejmują niepatogenne szczepy mikroorganizmów (poziom bezpieczeństwa biologicznego 1, BSL-1). W przypadku pracy z organizmami BSL-2 manipulacje te muszą odbywać się w komorze bezpieczeństwa biologicznego. Zapoznaj się z aktualnym wydaniem Raportu o bezpieczeństwie biologicznym w laboratoriach mikrobiologicznych i biomedycznych (BMBL) oraz z kartami charakterystyki substancji zakaźnych (MSDS) dla substancji zakaźnych, aby określić klasyfikację zagrożenia biologicznego, a także środki ostrożności i urządzenia zabezpieczające wymagane dla danego mikroorganizmu. Szczepy bakteryjne i zapasy fagów można uzyskać od badaczy, firm i kolekcji utrzymywanych przez określone organizacje, takie jak American Type Culture Collection (ATCC). Zaleca się stosowanie szczepów niepatogennych podczas nauki różnych metod posiewu. Postępując zgodnie z procedurami opisanymi w niniejszym protokole, uczniowie powinni być w stanie:

● Wykonuj procedury galwaniczne bez zanieczyszczania mediów.
● Izolować pojedyncze kolonie bakteryjne metodą powlekania smugowego.
● Stosuj metody powlekania i rozsiewania w celu określenia stężenia bakterii.
● Wykonuj miękkie nakładki agarowe podczas pracy z phage.
● Przenieś komórki bakteryjne z jednej płytki na drugą za pomocą procedury posiewu repliki.
● Biorąc pod uwagę zadanie eksperymentalne, wybierz odpowiednią metodę powlekania.

Protokół

1. Przygotowanie bezpiecznego i sterylnego miejsca pracy

1. Należy zapoznać się ze wszystkimi zasadami laboratoryjnymi i środkami ostrożności dotyczącymi pracy z mikroorganizmami. Niezależnie od klasyfikacji zagrożenia biologicznego, wszystkie materiały mające kontakt z mikroorganizmami są uznawane za odpady zakaźne i muszą zostać zdekontaminowane przed utylizacją. Należy przestrzegać wytycznych dotyczących bezpieczeństwa dostarczonych przez instytucjonalne działy BHP (Environmental Health and Safety), przygotowując odpowiednie pojemniki na odpady w celu natychmiastowej i prawidłowej utylizacji materiałów potencjalnie skażonych (zagrożeń biologicznych).
2. Przed użyciem do procedur wysiewu należy wysterylizować wszystkie instrumenty, roztwory i pożywki.
3. Należy uprzątnąć wszystkie zbędne materiały z obszaru roboczego na blacie laboratoryjnym.
4. Obszar roboczy należy oczyścić środkiem dezynfekcyjnym, aby zminimalizować możliwość kontaminacji.
5. Należy przygotować palnik Bunsena i pracować powoli, ostrożnie i rozważnie w obszarze pola sterylnego utworzonego przez prąd wstępujący płomienia.
   • W przypadku pracy z organizmami klasy BSL-2, stanowisko pracy należy przygotować w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wewnątrz komory nie wolno używać palnika Bunsena, ponieważ ciepło płomienia zaburza przepływ powietrza niezbędny do jej prawidłowego funkcjonowania.
6. Wszystkie materiały niezbędne do przeprowadzenia procedury należy rozmieścić na blacie laboratoryjnym w pobliżu pola sterylnego. Należy upewnić się, że wszystkie materiały są prawidłowo oznakowane. Organizacja obszaru roboczego w celu maksymalizacji wydajności pracy i uniknięcia zbędnych ruchów zminimalizuje czas narażenia materiałów eksperymentalnych na zanieczyszczenia obecne w powietrzu.
   • Palnik Bunsena należy umieścić po prawej stronie na blacie.
   • Szalki z agarem lub szalki Petriego należy umieścić po lewej stronie.
   • Kultury komórkowe, probówki, kolby i butelki należy rozmieścić w centralnej części blatu.
   • Nakrętki probówek, kolb i butelek należy poluzować, aby można było je łatwo otworzyć jedną ręką podczas kolejnych manipulacji.
7. Przed pracą z mikroorganizmami należy dokładnie umyć ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą.

2. Procedura posiewu smugowego: Izolacja kolonii bakteryjnych metodą ćwiartkową

Procedura posiewu metodą kreskową służy do izolowania czystych kultur bakterii, czyli kolonii, z populacji mieszanych poprzez proste oddzielenie mechaniczne. Pojedyncze kolonie składają się z milionów komórek rosnących w skupisku na płytce agarowej lub w jej wnętrzu (Rycina 1). Kolonia, w przeciwieństwie do pojedynczej komórki, jest widoczna gołym okiem. Teoretycznie wszystkie komórki w kolonii pochodzą od jednej bakterii początkowo naniesionej na płytkę, dlatego określa się je mianem klonu lub skupiska genetycznie identycznych komórek.

• Bakterie występują w różnych kształtach i rozmiarach. Na przykład pojedyncze komórki Escherichia coli mają kształt pałeczek o średniej długości 2 μm i szerokości 0,5 μm, natomiast komórki Streptococcus są sferyczne o średniej średnicy 1 μm. Niektóre bakterie (takie jak E. coli) występują jako pojedyncze komórki, podczas gdy inne tworzą charakterystyczne wzory asocjacji. Streptococcus rosną na przykład w parach lub tworzą łańcuchy bądź skupiska komórek. Zazwyczaj przyjmuje się, że pojedyncza kolonia powstaje z jednej komórki podlegającej podziałowi binarnemu; założenie to nie jest jednak prawdziwe dla bakterii, które naturalnie występują w parach, łańcuchach lub skupiskach, bądź dzielą się za pomocą innych mechanizmów. Alternatywnie, jeśli na płytkę wysieje się zbyt wiele bakterii, może dojść do nakładania się komórek, co zwiększa prawdopodobieństwo, że dwie lub więcej bakterii da początek temu, co wygląda na pojedynczą kolonię. Aby uniknąć tych komplikacji podczas opisywania lub enumeracji kultur bakteryjnych rosnących na podłożu stałym, kolonie określa się jako jednostki tworzące kolonie (cfu).

W procedurze posiewu metodą kreskową mieszaninę komórek rozprowadza się po powierzchni półstałego, agarowego podłoża odżywczego w szalce Petri w taki sposób, aby coraz mniejsza liczba komórek bakteryjnych była osadzana w szeroko rozdzielonych punktach na powierzchni podłoża, co po inkubacji prowadzi do rozwoju kolonii. W niniejszym materiale opisana zostanie metoda kwadrantowa izolowania pojedynczych kolonii z mieszaniny komórek.

1. Posiewy metodą kreskowania można wykonywać za pomocą kilku różnych narzędzi (Rysunek 2). Metalową pętlę można wykorzystywać wielokrotnie; służy ona do kreskowania rutynowych szczepów laboratoryjnych. W handlu dostępne są jednorazowe pętle plastikowe, które stosuje się częściej podczas pracy ze szczepami BSL-2 w komorze z laminarnym przepływem powietrza. Wielu naukowców preferuje stosowanie jednorazowych, wysterylizowanych patyczków drewnianych lub płaskich wykałaczek do kreskowania. Stanowią one niedrogą alternatywę dla plastikowych pętli i mogą być szczególnie użyteczne podczas pracy z próbkami środowiskowymi, takimi jak gleba, która prawdopodobnie zawiera bakterie przetrwalnikujące.
   • Jednorazowe wysterylizowane patyczki i wykałaczki nie wymagają opalania palnikiem Bunsena, co zapobiega niepotrzebnej aerozolizacji bakterii przetrwalnikujących oraz zanieczyszczeniu powierzchni laboratoryjnych lub szalek z agarem zarodnikami.
2. Opisz brzeg dna (nie pokrywki) szalki z agarem, podając co najmniej swoje imię i nazwisko, datę, rodzaj pożywki oraz rodzaj organizmu, który ma zostać wysiany na pożywkę.
   • Przed przystąpieniem do kreskowania szalki muszą być całkowicie suche, bez kondensacji pary wodnej na pokrywce i ogrzane do temperatury pokojowej. Jeśli szalki są przechowywane w temperaturze 4 °C, należy je wyjąć na kilka godzin lub nawet dzień wcześniej. Rozłóż je w niewielkich, przesuniętych stosach po nie więcej niż 2-3 szalki i pozostaw do wyschnięcia.
3. Próbka, z której pobierany jest materiał do posiewu, może być zawiesiną komórek w bulionie lub istniejącą kolonią z innej szalki z agarem. Na początku zaleca się, aby jedną szalkę zaszczepić tylko jedną próbką. Aby zaoszczędzić czas i materiały, można wykorzystać jedną szalkę do wielu próbek, ale dopiero po opanowaniu techniki kreskowania jednej próbki na szalce.
4. W przypadku pierwszego sektora próbkę pobiera się i rozprowadza na około jednej czwartej powierzchni pożywki, wykonując szybkie, płynne ruchy w przód i w tył (Panel A na Rysunku 3). Unieś dno odwróconej szalki z blatu. Przesuwaj pętlę, patyczek lub wykałaczkę wielokrotnie w przód i w tył po powierzchni agaru, od krawędzi do centrum szalki.
   • Jeśli inokulum jest zawiesiną komórek, pobierz jedną pętlę metalową lub od 5 do 10 μl za pomocą mikropipety. Przed pobraniem aalikwotu do wysiewu należy wymieszać zawiesinę komórek poprzez wirowanie w wirówce typu vortex lub delikatne potrząsanie. Podczas tego kroku stosuj technikę aseptyczną, opalając nie tylko pętlę, ale także szyjkę butelki lub probówki przed i po pobraniu inokulum. Ponadto nie dotykaj ścianek probówki lub butelki pętlą ani końcówką mikropipety. W przypadku pipetowania inokulum, nanieś zawiesinę komórek w odpowiednie miejsce na szalce, a następnie użyj pętli, patyczka lub wykałaczki, aby rozprowadzić ją w pierwszym sektorze szalki.
   • Jeśli inokulum jest kolonią z innej szalki, delikatnie dotknij kolonii pętlą, patyczkiem lub wykałaczką, a następnie rozprowadź ją w pierwszym sektorze szalki. Upewnij się, że metalowa pętla ostygła przed dotknięciem kolonii. Aby sprawdzić, czy pętla nie jest zbyt gorąca, dotknij jej lekko agaru w wyznaczonym obszarze, w którym nie będzie wykonywane kreskowanie. Z kolonii potrzeba jedynie kilku komórek, nie całej kolonii.
   • W przypadku użycia metalowej pętli, opal ją palnikiem Bunsena przed pobraniem inokulum na szalkę (Panel B na Rysunku 3). Zacznij około 3-4 cali od pętli, umieszczając drut w czubku niebieskiego stożka, czyli w najgorętszej części płomienia. Metal powinien rozżarzyć się do czerwoności. Przesuwaj drut tak, aby płomień zbliżył się do pętli. Taka manipulacja zapobiega aerozolizacji bakterii pozostałych na pętli po poprzednim użyciu.
   • Opalanie zabija bakterie (choć nie przetrwalniki), a prądy konwekcyjne powstające z rozgrzanego powietrza zapobiegają osiadaniu innych zanieczyszczeń z powietrza na metalowym drucie podczas kolejnych czynności.
   • Używając sterylnej płaskiej wykałaczki, trzymaj jej wąski koniec delikatnie między kciukiem a palcem serdecznym pod kątem od 10 do 20° do pożywki i używaj szerokiego końca do kreskowania sektorów. W przypadku użycia pętli lub patyczka drewnianego, trzymaj go jak ołówek pod tym samym kątem. Nie naciskaj zbyt mocno, aby pętla, patyczek lub wykałaczka nie wgniatały się w agar.
5. Po ukończeniu pierwszego sektora, odwróć szalkę i odstaw ją pokrywką do dołu na blat. Wyrzuć patyczek lub wykałaczkę albo ponownie opal metalową pętlę zgodnie z opisem w kroku nr 4.
6. Obróć szalkę Petriego o 90°, aby wykonać kreskowanie w drugim sektorze. Unieś dno odwróconej szalki z blatu, a następnie dotknij pętlą, patyczkiem lub wykałaczką pierwszego sektora w pobliżu końca ostatniej kreski. Wykonując ruchy w przód i w tył, przetnij ostatnią połowę kresek w pierwszym sektorze, a następnie przejdź do pustego drugiego sektora. Po wypełnieniu drugiego sektora odwróć szalkę i odstaw ją pokrywką do dołu na blat.
   • Pętla, patyczek lub wykałaczka nigdy nie powinny wracać do pierwszej połowy kresek w pierwszym sektorze, gdzie naniesiono większość pierwotnego inokulum.
   • Dla każdego sektora należy użyć nowej pętli plastikowej, patyczka drewnianego lub wykałaczki.
7. Powtórz krok nr 6 dwukrotnie dla trzeciego i czwartego sektora.
   • Pamiętaj o wyrzuceniu patyczka lub wykałaczki lub ponownym opaleniu metalowej pętli pomiędzy każdym sektorem.
   • Podczas kreskowania czwartego sektora unikaj wchodzenia w obszar pierwszego sektora.
8. Inkubuj szalkę odwróconą do góry dnem, aby kondensat gromadzący się na pokrywce nie skapywał na kolonie.

3. Procedura wysiewu wg metody płytkowej: Oznaczanie liczby komórek bakteryjnych w próbce mieszanej

Metodę tę często stosuje się do oznaczania liczby drobnoustrojów w próbce mieszanej, którą dodaje się do stopionego podłoża agarowego przed jego zastygnięciem. Proces ten pozwala na uzyskanie kolonii równomiernie rozłożonych w całej objętości stałego podłoża, pod warunkiem wysiania odpowiednio rozcieńczonej próbki. Technika ta służy do wykonywania siewów ilościowych, w których zlicza się całkowitą liczbę jednostek tworzących kolonie (CFU) wewnątrz agaru oraz na jego powierzchni na jednej płytce. Siewy ilościowe stanowią dla naukowców zestandaryzowany sposób generowania krzywych wzrostu, obliczania stężenia komórek w probówce, z której pobrano próbkę do wysiania, a także badania wpływu różnych środowisk lub warunków hodowli na przeżywalność komórek bakteryjnych lub tempo ich wzrostu.

1. Oznacz krawędź dna (nie pokrywkę) sterylnej, pustej szalki Petriego, wpisując co najmniej swoje imię i nazwisko, datę, rodzaj pożywki wzrostowej oraz rodzaj organizmu, który zostanie dodany do roztopionego agaru.
   • Uwzględnij czynnik rozcieńczenia w przypadku wysiewu rozcieńczeń seryjnych, czyli serii powtórzonych rozcieńczeń, które prowadzą do systematycznej redukcji stężenia komórek w próbce. Przygotowanie rozcieńczeń seryjnych jest konieczne, jeśli liczba komórek w próbce przekracza pojemność szalki z agarem, w której zakres statystycznie istotny wynosi od 30 do 300 cfu. Jeśli na szalce znajduje się więcej niż 300 cfu, kolonie będą zbyt gęste i będą na siebie nachodzić.
2. Pobierz probówkę zawierającą 18 ml roztopionej pożywki agarowej.
   • Pożywkę agarową należy rozlać do probówek i wstępnie wysterylizować w autoklawie. W dniu planowanego eksperymentu agar należy roztopić w sterylizatorze parowym przez 30 minut, a następnie przenieść do łaźni wodnej o temperaturze 55 °C. Należy roztopić tylko tyle agaru, ile jest potrzebne do eksperymentu, ponieważ nie można go użyć ponownie.
   • Na dziesięć minut przed wylewaniem szalek probówki z roztopionym agarem należy przenieść z łaźni wodnej 55 °C do bloku grzejnego na stole laboratoryjnym ustawionego na 48 °C. Gdy agar osiągnie tę temperaturę, jest gotowy do wylewania. Jeśli agar będzie zbyt gorący, bakterie w próbce mogą zostać zabite. Jeśli agar będzie zbyt zimny, po zastygnięciu pożywka może mieć grudki.
3. Pobierz próbkę, która powinna być kulturą w bulionie lub zawiesiną komórek otrzymaną przez wymieszanie komórek z kolonii z buforem lub solą fizjologiczną.
   • Próbki mogą pochodzić z serii rozcieńczeń jednej próbki.
   • Objętość próbki do wysiewu powinna wynosić od 0.1 do 1.0 ml.
4. Otwórz pokrywkę pustej szalki Petriego i nanieś próbkę na środek szalki (Panel A na Rysunku 4). Zamknij pokrywkę.
   • Przez cały czas trwania tej procedury stosuj techniki aseptyczne.
   • Do przeniesienia próbki na szalkę użyj pipety serologicznej lub mikropipety. Kontroluj przepływ próbki, aby nie rozprysnęła się poza szalkę.
5. Zdejmij korek z probówki z roztopionym agarem i przeprowadź krawędź otwartej probówki przez płomień palnika Bunsena.
6. Otwórz pokrywkę szalki Petriego zawierającej próbkę i ostrożnie wlej agar (Panel B na Rysunku 4). Zamknij pokrywkę, a następnie wymieszaj próbkę z agarem, delikatnie obracając szalką ruchem okrężnym.
7. Pozostaw agar do całkowitego zastygnięcia przed odwróceniem szalki w celu inkubacji.

4. Procedura wysiewu powierzchniowego: Formowanie odrębnych kolonii bakterii do zliczania na płytkach, namnażania, selekcji lub przesiewania

Technika ta jest zazwyczaj stosowana do rozdzielania mikroorganizmów zawartych w małej objętości próbki, którą rozprowadza się po powierzchni płytki z agarem, co przy wysianiu odpowiedniego stężenia komórek prowadzi do powstania odrębnych kolonii rozmieszczonych równomiernie na powierzchni agaru. Poza wykorzystaniem tej techniki do oznaczania liczby żywych drobnoustrojów metodą płytkową, w której zlicza się całkowitą liczbę jednostek tworzących kolonie na jednej płytce i wykorzystuje ją do obliczenia stężenia komórek w probówce, z której pobrano próbkę, metodę wysiewu powierzchniowego rutynowo stosuje się w eksperymentach z wzbogacaniem, selekcją i przesiewaniem. Pożądany wynik w tych trzech rodzajach doświadczeń jest zazwyczaj taki sam jak w przypadku oznaczania liczby komórek na płytkach, polegający na utworzeniu rozkładu odrębnych kolonii na powierzchni agaru. Celem nie jest jednak zapewnienie, aby wszystkie żywe komórki utworzyły kolonie. Zamiast tego powinny urosnąć tylko te komórki w populacji, które posiadają określony genotyp. Procedura wysiewu powierzchniowego może być preferowana nad techniką wysiewu wgłębnego w eksperymentach ilościowych, jeśli celem końcowym jest izolacja kolonii do dalszych analiz, ponieważ kolonie rosną w sposób dostępny na powierzchni agaru, podczas gdy w procedurze wysiewu wgłębnego zostają one zatopione w agarze.

Opisano tutaj dwie strategie przeprowadzenia procedury wysiewu metodą rozlewania. Pierwsza z nich (Metoda A) wykorzystuje obrotowy stolik oraz szklany lub metalowy pręcik w kształcie kija hokejowego. Druga (Metoda B), nazywana „metodą Copacabana”, polega na wstrząsaniu wstępnie wysterylizowanymi szklanymi kuleczkami. Obie metody ułatwiają równomierne rozprowadzenie komórek na powierzchni agaru.

Metoda A: Wysiew powierzchniowy z użyciem obrotowego stołu i szklanego lub metalowego pręta

1. Opisz brzeg dna (nie pokrywki) szalki z agarem, podając co najmniej swoje imię i nazwisko, datę, rodzaj pożywki oraz rodzaj organizmu, który ma zostać wysiany na podłoże.
   • W przypadku wysiewu rozcieńczeń seryjnych podaj czynnik rozcieńczenia.
   • Szalki muszą być całkowicie suche, bez kondensacji pary wodnej na pokrywce i ogrzane do temperatury pokojowej przed wysiewem metodą rozcierania. Jeśli szalki są przechowywane w temperaturze 4 °C, należy je wyjąć kilka godzin lub nawet dzień wcześniej. Rozłóż je w małych, przesuniętych stosach nieprzekraczających 2-3 szalek i pozostaw do wyschnięcia.
2. Ustaw szalkę centralnie na obrotowym stole (Rycina 5).
3. Przygotuj próbkę, która powinna być kulturą w bulionie lub zawiesiną komórek otrzymaną poprzez wymieszanie komórek z kolonii z buforem lub solą fizjologiczną.
   • Próbki mogą pochodzić z serii rozcieńczeń jednej próbki.
   • Objętość próbki do wysiewu powinna wynosić od 0.1 do 0.2 ml.
4. Otwórz pokrywkę szalki Petriego i nanieś próbkę na środek agaru. Zamknij pokrywkę.
   • Przez cały czas trwania tej procedury stosuj techniki aseptyczne.
   • Do przeniesienia próbki na szalkę użyj mikropipety. Kontroluj przepływ próbki tak, aby nie rozprysnęła się poza obszar szalki.
5. Zanurz szklaną lub metalową rozpylarkę (zwaną również rozcieraczem) w zlewce z 70% (v/v) etanolem.
   • UWAGA: Nigdy nie zanurzaj gorącej rozpylarki w zlewce z alkoholem.
   • Etanol powinien dotykać tylko dolnej części rozpylarki oraz pierwszego cala trzonka.
6. Odsącz i wypal nadmiar etanolu, przeprowadzając rozpylarkę przez płomień palnika Bunsena.
   • Płomień powinien przejść wzdłuż długości rozpylarki i trzonka, które miały kontakt z etanolem, a następnie szybko zgasnąć.
   • W przypadku zapalenia się etanolu w zlewce nie panikuj! Przykryj zlewkę szklaną pokrywką, co szybko ugasi ogień.
7. Otwórz pokrywkę szalki z agarem, trzymając ją w lewej ręce kciukiem i palcem wskazującym. Ochłoć rozpylarkę, dotykając jej agaru wzdłuż brzegu blisko krawędzi.
   • Nie dotykaj agaru w miejscu, w którym naniesiono komórki. Gorąca rozpylarka zabije komórki.
8. Lewą ręką (nadal trzymając pokrywkę szalki z agarem) powoli obracaj stołem obrotowym.
   • Choć najlepiej tego unikać, jeśli musisz odłożyć pokrywkę, połóż ją stroną wierzchnią do dołu na zdezynfekowanej powierzchni w sterylnym polu palnika Bunsena. W przypadku położenia pokrywki stroną wierzchnią do góry istnieje większe ryzyko kontaminacji spowodowanej ruchami przedmiotów lub rąk, co tworzy prądy powietrzne powodujące opadanie mikroorganizmów i cząsteczek kurzu na wewnętrzną powierzchnię pokrywki.
9. Prawą ręką delikatnie przyciśnij rozpylarkę do powierzchni agaru i stopniowo rozprowadź próbkę równomiernie po całej szalce. Poruszaj rozpylarką w przód i w tył w poprzek szalki podczas obrotu stołu.
10. Pozostaw próbkę do całkowitego wchłonięcia (przez co najmniej 5 minut) przed odwróceniem szalki do inkubacji.

Metoda B: Wysiew powierzchniowy z użyciem szklanych kulek: „metoda Copacabana”

1. Oznacz brzeg dna (nie pokrywkę) szalki z agarem, podając co najmniej swoje nazwisko, datę, rodzaj pożywki oraz gatunek organizmu, który ma zostać wysiany na podłoże.
   • W przypadku wysiewania rozcieńczeń seryjnych podaj współczynnik rozcieńczenia.
2. Otwórz pokrywkę szalki z agarem, trzymając ją w lewej ręce kciukiem i palcem wskazującym. Następnie otwórz probówkę lub butelkę ze wstępnie wysterylizowanymi szklanymi kuleczkami. Prawą ręką wysterylizuj płomieniem wylot probówki lub butelki, a następnie ostrożnie wysyp 10-12 sterylnych szklanych kuleczek na szalkę z agarem (Rycina 6). Zamknij pokrywkę szalki i ponownie wysterylizuj płomieniem wylot probówki lub butelki przed założeniem korka i odstawieniem naczynia.
   • Kuleczki wysypuj powoli z probówki lub butelki kilka centymetrów nad agarem, aby nie wyskoczyły poza szalkę Petriego.
   • Używaj szklanych kuleczek o średnicy 4 mm. Sterylizuj je w szklanych butelkach lub probówkach w autoklawie w temperaturze 121 °C w cyklu suchym (ustawienie grawitacyjne) przez 30 minut.
   • Zaletą stosowania kuleczek zamiast rozpylacza jest brak konieczności używania otwartych pojemników z etanolem do wielokrotnej sterylizacji płomieniem.
3. Otwórz pokrywkę szalki z agarem i nanieś próbkę na środek agaru. Zamknij pokrywkę.
   • Przez cały czas trwania procedury stosuj techniki aseptyczne.
   • Nanieś od 100 do 150 μl próbki na szalkę. Taka objętość ułatwi równomierne rozprowadzenie komórek. Do przeniesienia próbki na szalkę użyj mikropipety. Kontroluj przepływ próbki, aby nie rozprysnęła się poza szalkę.
4. Rozprowadź próbkę, delikatnie potrząsając kuleczkami po powierzchni agaru od 6 do 7 razy. Aby zapewnić równomierne rozprowadzenie komórek, wykonuj poziome ruchy potrząsania.
   • Nie wykonuj ruchów obrotowych kuleczkami, w przeciwnym razie wszystkie komórki zgromadzą się przy krawędzi szalki.
   • WSKAZÓWKA: Jeśli czynność jest wykonywana prawidłowo, procedura brzmi jak „granie na marakasach”.
5. Obróć szalkę o 60°, a następnie ponownie potrząśnij poziomo 6 do 7 razy.
6. Obróć szalkę o 60° po raz drugi i ponownie potrząśnij poziomo. Na tym etapie powinno zostać osiągnięte równomierne rozprowadzenie komórek na powierzchni agaru.
7. Po zakończeniu wysiewu próbka powinna zostać wchłonięta, a powierzchnia agaru powinna być sucha. Zlej zanieczyszczone kuleczki do oznakowanego zlewka zbiorczego zawierającego 10% wybielacz chlorowy.
   • Nie wyrzucaj kuleczek do kosza! Zużyte kuleczki zostaną wypłukane i poddane autoklawowaniu w celu ponownej sterylizacji do wielokrotnego użytku.
   • UWAGA: Jeśli powierzchnia agaru jest wciąż mokra po trzykrotnym potrząsaniu, odstaw szalkę na kilka minut, aby ciecz została wchłonięta przez agar, a następnie powtórz kroki nr 4-6, aż powierzchnia szalki będzie wydawać się sucha.
8. Odwróć szalkę do góry dnem przed inkubacją.

5. Procedura nakładania miękkiego agaru: Tworzenie placków w celu izolacji i enumeracji fagów (metoda plackowa)

Technikę tę powszechnie stosuje się do wykrywania i oznaczania ilościowego bakteriofagów (fagów), czyli wirusów bakteryjnych o rozmiarach od 100 do 200 nm. Do obserwacji pojedynczych cząstek fagów niezbędny jest mikroskop elektronowy. Obecność zakaźnych cząstek fagów można jednak wykryć w postaci plam lizolitycznych na płytce z agarem (Rysunek 7A). Fagi nie mogą namnażać się poza komórkami bakterii gospodarza, dlatego ich propagacja i detekcja wymagają wymieszania fagów z komórkami gospodarza przed wysianiem na płytkę. W procedurze z nakładką z miękkiego agaru, niewielką objętość zawiesiny fagowej, zazwyczaj w zakresie od 50 μl do 200 μl, dozuje się do probówki zawierającej około 10⁸ bakterii (komórek gospodarza), które są równomiernie rozproszone w 2,5-3,0 ml stopionego miękkiego (0,5 do 0,7% [w/v]) agaru odżywczego. Otrzymaną mieszaninę wylewa się na powierzchnię twardej (1,5 do 1,9% [w/v]) płytki z agarem odżywczym. Płytkę kołysze się wystarczająco, aby miękki agar pokrył całą powierzchnię twardego agaru. Następnie płytkę umieszcza się na płaskiej powierzchni do czasu stężenia górnej warstwy agaru, po czym można ją przenieść do inkubatora.

Z czasem w miękkim agarze staje się widoczna zmętniona zawiesina komórek bakteryjnych, nazywana trawnikiem (Rysunek 7B). Plaki powstają, gdy fag zainfekuje jedną z komórek bakteryjnych, powieli się wewnątrz niej, a następnie zlizuje komórkę, uwalniając nawet 100 fagów potomnych (tzw. wielkość wyrzutu). Nowe cząsteczki fagów dyfundują w miękkim agarze, infekując bakterie w obszarze otaczającym zlizowaną komórkę bakteryjną. Po wielu cyklach infekcji i lizy zmętniona zawiesina komórek bakteryjnych w miękkim agarze znika, pozostawiając strefę przejaśnienia zwaną plakiem. Każdy plak zawiera ponad 10⁹ cząsteczek fagów, które są genetycznie identyczne z pierwotną zakaźną cząsteczką faga. Ponieważ plak powstaje z pojedynczej cząsteczki faga, można policzyć powstałą liczbę jednostek tworzących plaki (pfu) i obliczyć pierwotne stężenie, czyli miano, zawiesiny fagów. Ten rodzaj eksperymentu, nazywany metodą plackową, zapewnia naukowcom również standaryzowany sposób generowania jednokrokowych krzywych wzrostu, badania specyficzności zakresu gospodarzy oraz transdukcji komórek bakteryjnych do eksperymentów genetycznych.

1. Przygotowanie bakterii wskaźnikowych: Do eksperymentu z nakładaniem miękkiego agaru należy przygotować kulturę bakterii gospodarza w fazie wzrostu wykładniczego. Każdy gospodarz ma specyficzne wymagania wzrostowe. Na każdą płytkę wymagane jest od 0,3 ml do 0,5 ml zawiesiny bakterii wskaźnikowych. W przypadku przygotowania kolby bakterii wskaźnikowych (np. 25 ml), kulturę należy podzielić na mniejsze alikwoty (np. alikwoty 5 ml rozlane do sterylnych probówek z nakrętką), aby zminimalizować ryzyko zanieczyszczeń krzyżowych. Probówki można przechowywać w lodzie (w 4 °C) do momentu użycia w eksperymencie. Należy zastosować technikę aseptyczną do zaszczepienia sterylnej pożywki płynnej, a następnie inkubować zgodnie ze specyfikacją szczepu bakteryjnego. Pozostałe kultury należy zutylizować na koniec dnia.
2. Przygotowanie probówek do adsorpcji: Umieść dwie sterylne probówki do mikrowirówki w statywie. Oznacz pokrywkę pierwszej probówki jako „Fag”, a pokrywkę drugiej probówki jako „Kontrola”.
   • Zazwyczaj przygotowuje się rozcieńczenia seryjne lizatów fagowych i nanosi je na płytki; w takim przypadku do statywu należy dodać dodatkowe probówki do mikrowirówki i oznaczyć je współczynnikiem rozcieńczenia.
   • Zapasy fagów powinny być świeżo przygotowane z pojedynczych plam lizy i przechowywane w 4 °C. Aby rozagregować cząstki fagów, zapasy należy ogrzać do temperatury otoczenia przed przystąpieniem do eksperymentu.
   • Z zapasami fagów należy obchodzić się delikatnie – nie wolno ich mieszać w wirówce typu vortex ani pipetować gwałtownie.
3. Do pierwszej probówki dodaj 50 μl próbki faga, a do drugiej probówki dodaj 50 μl buforu do fagów, która będzie służyć jako kontrola negatywna w teście plam lizy.
   • Przez cały czas manipulowania fagami i bakteriami należy stosować technikę aseptyczną.
4. Następnie do każdej probówki do adsorpcji dodaj 500 μl bakterii wskaźnikowych.
   • Komórki bakteryjne osiadają na dnie probówki, jeśli pozostają w lodzie lub na blacie przez dłuższy czas. Jeśli kultura nie zostanie wymieszana przed pobraniem alikwotu do eksperymentu, do probówki do adsorpcji zostanie przeniesiona niewystarczająca liczba komórek bakteryjnych. W miękkim agarze musi powstać wystarczająca liczba kolonii bakteryjnych (tj. trawnik), aby można było wykryć plamy lizy. Przed przeniesieniem alikwotów do probówek do adsorpcji należy użyć mieszadła typu vortex, aby delikatnie zawiesić bakterie wskaźnikowe w formie jednorodnej zawiesiny.
5. Wymieszaj komórki bakteryjne i fagi, delikatnie stukując probówkami o dłoń.
6. Inkubuj mieszaninę fagów i bakterii przez 15-20 minut (nie dłużej niż 30 minut) w temperaturze odpowiedniej dla szczepu wskaźnikowego.
7. Przygotowanie płytek z miękkim agarem odżywczym i twardym agarem: Podczas gdy trwa adsorpcja, umieść dwie probówki z miękkim agarem (wcześniej roztopione i przechowywane w 55 °C) w bloku grzejnym na blacie laboratoryjnym ustawionym na 46-48 °C.
   • Roztopiony miękki agar musi być wyrównywany do temperatury bloku grzejnego przez 10-15 minut. Jeśli roztopiony miękki agar będzie stał dłużej niż 15 minut, zacznie twardnieć i utworzy grudki podczas wylewania na twardy agar. Jeśli roztopiony miękki agar będzie stał krócej niż 10 minut, będzie zbyt gorący podczas dodawania do mieszaniny fagów i bakterii, co zabije komórki gospodarza przed wysianiem na płytkę. W konsekwencji trawnik może nie powstać, a plamy lizy mogą być nieliczne lub niewykrywalne.
   • Przygotuj dodatkowe probówki z miękkim agarem, jeśli wysiewasz rozcieńczenia seryjne lizatu fagowego.
8. Na brzegu dna (nie na pokrywce) dwóch płytek z twardym agarem odżywczym zapisz co najmniej swoje imię i nazwisko, datę, rodzaj pożywki oraz „Fag” lub „Kontrola” w odniesieniu do probówek do adsorpcji.
   • W przypadku wysiewu rozcieńczeń seryjnych dołącz dodatkowe płytki oznaczone współczynnikiem rozcieńczenia.
   • Płytki z twardym agarem muszą być całkowicie suche, bez kondensacji na pokrywce i wstępnie ogrzane do temperatury pokojowej przed dodaniem miękkiego agaru. Jeśli płytki są przechowywane w 4 °C, wyjmij je kilka godzin lub nawet dzień wcześniej. Rozłóż je w małych, przesuniętych stosach nie większych niż 2-3 płytki i pozwól im wyschnąć. Nadmierna wilgoć w warstwie twardego agaru spowoduje rozcieńczenie miękkiego agaru, co umożliwi fagom łatwiejszą dyfuzję przez miękki agar podczas tworzenia plam lizy. W konsekwencji rozmiar plam lizy ulegnie zwiększeniu.
9. Wysiewaj zawartość probówek do adsorpcji jedna po drugiej w następujący sposób: Używając mikropipety P1000, aseptycznie przenieś mieszaninę fagów i bakterii (powinno być około 550 μl) do probówki z miękkim agarem, a następnie szybko obracaj ją między dłońmi, aby wymieszać zawartość. NIE potrząsaj probówką, aby nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Trzymając probówkę w lewej ręce, otwórz prawą ręką pokrywkę płytki z twardym agarem i natychmiast wlej całą zawartość probówki na powierzchnię płytki z twardym agarem. Przed zamknięciem pokrywki delikatnie, ale szybko kołysz płytką, aby rozprowadzić roztopiony miękki agar po całej powierzchni płytki, zanim zdąży on zastygnąć. Unikaj rozpryskiwania roztopionego miękkiego agaru na ścianki szalki Petriego. Zamknij pokrywkę.
10. Powtórz krok nr 9 dla wszystkich probówek do adsorpcji, po jednej probówce na raz.
11. Umieść płytki na płaskiej powierzchni i pozostaw je w spokoju, aż miękki agar zastygnie.
    • Zazwyczaj 30 minut jest wystarczające.
12. Odwróć płytki do góry dnem w celu inkubacji.
    • Kilka płytek można ułożyć w stos, zabezpieczyć taśmą, a następnie odwrócić do inkubacji.

Po inkubacji można sprawdzić płytki pod kątem obecności placków. W kontroli negatywnej powinien znajdować się jedynie trawnik bakterii (bez otworów wskazujących na obecność placków). Placki różnią się rozmiarem, kształtem i ogólnym wyglądem. Konkretny typ faga można wyizolować z heterogenicznej mieszaniny placków, ostrożnie pobierając środek jednego placka za pomocą sterylnego wykałaczki i przenosząc inokulum do sterylnej probówki do mikrocentryfugi zawierającej od 100 do 1000 μl bulionu lub buforu fagowego. Ten lizat można wysiać na płytki, stosując tę samą procedurę opisaną powyżej. Aby upewnić się, że uzyskano czysty fag, konieczne jest przeprowadzenie co najmniej 3 do 6 kolejnych izolacji z pojedynczych placków. Często lizat musi zostać rozcieńczony w szerokim zakresie (10^-1 do 10^-10), aby znaleźć miano, które pozwoli na uzyskanie niezachodzących na siebie placków na płytce. Liczba ta różni się w zależności od wielkości placka.

6. Procedura przygotowania płytek replikacyjnych: przenoszenie komórek w celu przesiewania mutantów i aukstrofów

Technika ta umożliwia porównanie wzrostu komórek na płytce pierwotnej z płytkami wtórnymi, co stanowi metodę przesiewową w celu wyłonienia komórek o określonym fenotypie. W pierwszej kolejności płytkę pierwotną (matkę) szczepi się komórkami, stosując metodę posiewu powierzchniowego rozcieńczenia pozwalającego na uzyskanie pojedynczych kolonii lub przenosząc je na płytkę w układzie przestrzennym wyznaczonym przez siatkę. Płytki wtórne zawierające pożywki z inhibitorami wzrostu lub pożywki pozbawione konkretnego składnika odżywczego są szczepione komórkami z kolonii znajdujących się na płytce pierwotnej. Układ przestrzenny kolonii jest powielany poprzez dociśnięcie kawałka aksamitu do płytki pierwotnej. Komórki bakteryjne przylegają do aksamitu, ponieważ wykazują one większe powinowactwo do tego materiału niż do agaru. Odcisk komórek na aksamicie jest następnie przenoszony na wiele płytek wtórnych, a wzrost komórek odzwierciedla ten sam wzór kolonii, co na płytce pierwotnej. Innymi słowy, działa to podobnie do pieczątki, replikując wzór wzrostu z jednej płytki na drugą. Technika ta jest korzystna, ponieważ pozwala na jednoczesne przesiewanie stosunkowo dużej liczby kolonii pod kątem wielu fenotypów w ramach jednego eksperymentu.

1. Przygotowanie płyty pierwotnej: Na krawędzi dna (nie pokrywki) płytki z agarem nanieś opis zawierający co najmniej imię i nazwisko, datę oraz rodzaj pożywki wzrostowej.
2. Wyznacz na dnie płytki siatkę składającą się z co najmniej dwóch równomiernie rozmieszczonych linii pionowych i co najmniej dwóch równomiernie rozmieszczonych linii poziomych. Ponumeruj powstałe kwadraty.
3. Za pomocą wysterylizowanego wykałaczką zaszczep każdą część siatki próbką komórek. W przypadku każdej próbki dotknij środka kwadratu. Nie pokrywaj komórkami całego kwadratu (Rycina 8), w przeciwnym razie próbka nadmiernie urośnie podczas inkubacji i zanieczyści sąsiednie kwadraty.
   • Każdy kwadrat zostanie zaszczepiony inną próbką, pochodzącą z kultur w bulionie lub kolonii z innej płytki.
4. Odwróć i inkubuj płytkę pierwotną, która posłuży do zaszczepienia różnych pożywek wtórnych.
5. Zaszczepianie płytek wtórnych: Ułóż w stos płytkę pierwotną oraz wszystkie płytki wtórne. Markerem nanieś znak orientacyjny na boku płytek. Upewnij się, że znak znajduje się na dnie każdej płytki, a nie na pokrywce.
6. Przygotuj sterylną tkaninę welurową i umieść ją na bloku cylindrycznym (Rycina 9). Zablokuj tkaninę welurową za pomocą uchwytu. Zwróć uwagę na znak orientacyjny na bloku.
   • Blok powinien mieć taki sam rozmiar jak dno szalki Petriego (średnica 10.2 cm). Powinien być wyposażony w pierścień blokujący, który dociska tkaninę welurową do bloku podczas przenoszenia kolonii (replica plating).
   • Tkanina welurowa (kwadrat 15.2 x 15.2 cm) musi być wcześniej wysterylizowana. Ułóż w stos 10 lub 12 czystych kwadratów, owiń je folią aluminiową, a następnie umieść w autoklawie w 121 °C w cyklu suchym (ustawienie grawitacyjne) przez 30 minut. Przed użyciem w eksperymencie z przenoszeniem kolonii upewnij się, że są one całkowicie suche, umieszczając je w ciepłym piekarniku na kilka godzin. Należy pamiętać, że kwadraty welurowe przed sterylizacją mogą wymagać usunięcia kłaczków za pomocą taśmy malarskiej.
   • Kwadraty welurowe można wykorzystać ponownie. Po odkażeniu zużytych kwadratów welurowych w autoklawie należy je wypłukać w czystej wodzie i ponownie wysterylizować zgodnie z powyższym opisem.
   • Blok cylindryczny i zacisk należy dezynfekować między użyciami poprzez krótkie płukanie w 70% (v/v) etanolu lub 10% roztworze wybielacza chlorowego.
7. Zdejmij pokrywkę i odwróć płytkę pierwotną. Dopasuj znak orientacyjny na płytce do znaku na bloku. Opuść płytkę tak, aby powierzchnia agaru stykała się z tkaniną welurową na bloku cylindrycznym. Lekko, ale równomiernie dociśnij opuszkami palców tył płytki pierwotnej, a następnie ostrożnie podnieś płytkę z bloku. Nałóż pokrywkę na płytkę.
   • Odcisk komórek na welurze z płytki pierwotnej można wykorzystać do zaszczepienia około 7-8 płytek wtórnych, zanim konieczne będzie wykonanie nowego odcisku świeżym welurem.
8. Powtórz krok nr 7 dla każdej z płytek wtórnych.
   • Jako kontrolę pozytywną ostatnia płytka w serii powinna zawierać pożywkę agarową, na której powinny rosnąć wszystkie badane szczepy. W ten sposób można potwierdzić, że komórki zostały przeniesione na wszystkie płytki wtórne w serii. W przeciwnym razie brak wzrostu na konkretnej pożywce testowej można by przypisać niewystarczającemu przeniesieniu komórek, a nie fenotypowi szczepu.
   • Aby uniknąć wyników fałszywie dodatnich, płytki wtórne powinny być ułożone od podłoża najmniej do najbardziej sprzyjającego wzrostowi. W przeciwnym razie składniki odżywcze mogłyby zostać przeniesione między płytkami, umożliwiając wzrost komórek na niekorzystnej pożywce.
9. Odwróć płytki i inkubuj.
   • Uwaga: Podczas sprawdzania wzrostu na płytkach wtórnych należy odróżnić rzeczywisty wzrost od odcisku. Ten drugi jest wynikiem negatywnym.

7. Sprzątanie miejsca pracy

1. Wyłączyć palnik Bunsena, a następnie uprzątnąć wszystkie materiały, w tym kultury na płytkach lub w probówkach, nadmiar pożywek oraz inne odczynniki.
   • Nie dopuszczać do gromadzenia się starych kultur, zarówno na płytkach, jak i w probówkach, na blacie laboratoryjnym ani w miejscach przechowywania. Próbki te, będące powszechnie znanymi źródłami kontaminacji, takimi jak pleśnie i niepożądane gatunki bakterii, należy utylizować niezwłocznie po tym, jak przestaną być potrzebne.
2. Umieścić zanieczyszczone materiały laboratoryjne (rękawiczki, końcówki do pipet, chusteczki wycierające), szkło laboratoryjne (probówki, kolby, butelki) oraz odpady niebezpieczne (kultury bakterii lub roztwory fagów, zużyte płytki) do odpowiedniego pojemnika na odpady. Podczas pracy z niepatogennym szczepem E. coli (BSL-1) powstają jedynie niezakaźne odpady niebezpieczne. Podczas wykonywania tych samych procedur z organizmami patogennymi (BSL-2 lub wyżej) powstają zakaźne odpady niebezpieczne. Niezależnie od klasyfikacji zagrożenia biologicznego, odpady niebezpieczne muszą zostać poddane autoklawowaniu lub dezynfekcji przed utylizacją. W celu natychmiastowej i prawidłowej utylizacji materiałów biologicznie niebezpiecznych powstałych podczas eksperymentu należy stosować się do wytycznych opisanych w BMBL (5^th Ed.) oraz do zasad przekazanych przez instytucjonalny dział BHP (Environmental Health and Safety).
3. Oczyścić obszar roboczy środkiem dezynfekcyjnym.
4. Przed opuszczeniem laboratorium dokładnie umyć ręce mydłem antyseptycznym i ciepłą wodą.

8. Reprezentatywne wyniki

Metoda posiewu smugowego. Przykładowe naniesienie próbki w posiewie smugowym przedstawiono na Rysunku 1. Procedurę tę stosuje się do izolowania kolonii bakteryjnych z mieszanych kultur komórkowych i jest ona jedną z najważniejszych technik, którą należy opanować w mikrobiologii i genetyce molekularnej. Każda kolonia reprezentuje populację komórek identycznych genetycznie. W wielu dalszych zastosowaniach konieczne jest rozpoczęcie pracy od pojedynczej kolonii lub czystej kultury bakteryjnej, uzyskanej poprzez zaszczepienie podłoży komórkami z pojedynczej kolonii. Na przykład morfologię poszczególnych komórek w obrębie kolonii można zbadać za pomocą mikroskopu świetlnego. Tożsamość genetyczną można ustalić poprzez sekwencjonowanie genu małej podjednostki rybosomalnego RNA z DNA genomicznego wyizolowanego z kultury komórkowej zapoczątkowanej od pojedynczej kolonii. Z kolei charakterystykę metaboliczną można opisać, poddając komórki różnym testom biochemicznym i fizjologicznym. Tylko przeprowadzając takie eksperymenty na kulturach czystych, można mieć pewność co do właściwości przypisywanych konkretnemu mikroorganizmowi. Wyniki nie są wtedy zafałszowane przez możliwość zanieczyszczenia kultury. Błędy techniczne mogą wystąpić, jeśli sterylność narzędzia używanego do smugowania komórek na płytce nie zostanie zachowana przez całą procedurę. Zapomnienie o wypaleniu pętli lub pobraniu nowego wykałaczkę pomiędzy kwadrantami utrudnia uzyskanie pojedynczych kolonii. Niektóre gatunki bakterii nie mogą być izolowane w kulturze czystej, ponieważ w odniesieniu do pewnych wymagań wzrostowych są one zależne od kooperacyjnej relacji z innym gatunkiem bakterii. Organizmy te, nazywane syntrofami, mogą być hodowane wyłącznie w warunkach kokultury, zatem kolonie (jeśli powstaną) zawsze będą składać się z dwóch lub więcej gatunków. Innym wyzwaniem napotykanym w laboratorium podczas wykonywania posiewu smugowego bakterii pochodzących z próbek środowiskowych jest fakt, że komórki wykazują cechy wzrostu odbiegające od tradycyjnych szczepów laboratoryjnych, takich jak E. coli. Takie szczepy bakteryjne mogą tworzyć kolonie nitkowate (w przeciwieństwie do zwartych skupisk komórek) z odnogami rozprzestrzeniającymi się na dużej powierzchni płytki z agarem, zwapniałe i tym samym oporne na penetrację narzędziem do posiewu smugowego, lub otoczone lepką otoczką, przez co nie można rozróżnić pojedynczych kolonii. Cechy te utrudniają oczyszczanie pojedynczych kolonii za pomocą metody posiewu smugowego.

Metoda podlewkowa. W metodzie podlewkowej kolonie tworzą się zarówno wewnątrz agaru, jak i na powierzchni pożywki agarowej, co stanowi wygodny sposób na zliczenie liczby żywych komórek w próbce. Procedura ta jest stosowana w wielu zastosowaniach przemysłowych. Na przykład w oczyszczalni ścieków, która odpowiada za oczyszczanie odpadów ciekłych (np. ścieków, spływów z odpływów deszczowych) generowanych przez nieruchomości mieszkalne, handlowe i przemysłowe, a także w wyniku praktyk rolniczych, kluczowe jest analizowanie próbek wody po rozległym procesie oczyszczania. Oczyszczone ścieki (woda niepitna) są wykorzystywane na różne sposoby – do nawadniania upraw nieżywnościowych w rolnictwie, do spłukiwania sanitarnych w domach oraz w przemysłowych wieżach chłodniczych – dlatego muszą być wolne od zanieczyszczeń chemicznych i mikrobiologicznych. Woda pitna musi być oczyszczana zgodnie ze standardami EPA i jest badana przy użyciu mikrobiologicznych metod wysiewu, które pozwalają na wyliczenie konkretnych patogenów ludzkich. Na Rysunku 10 przedstawiono kolonie bakterii powstałe z komórek bakteryjnych obecnych w próbce wody pobranej z publicznego ujęcia wody pitnej. Mało prawdopodobne jest, aby kolonie te wytworzyły patogeny bakteryjne, biorąc pod uwagę środki oczyszczania wody pitnej; niemniej jednak mikroby są wszędzie, a zanieczyszczenie nawet szczepami niepatogennymi można jedynie zminimalizować, a nie całkowicie wyeliminować. Jako kolejny przykład, firma farmaceutyczna musi ocenić stopień zanieczyszczenia mikrobiologicznego, czyli bioburden, nowego leku podczas produkcji, przechowywania i transportu. Poprzez pobieranie próbek leku w różnych fazach procesu i wysiewanie ich metodą podlewkową, można łatwo określić obciążenie mikrobiologiczne, czyli liczbę zanieczyszczających bakterii. Można wówczas opracować środki zapobiegawcze w celu zminimalizowania lub wyeliminowania zanieczyszczeń mikrobiologicznych. Jednym z najczęstszych błędów technicznych podczas wykonywania metody podlewkowej jest niewystarczające wymieszanie próbki z roztopionym agarem, co powoduje zlepianie się kolonii, czyniąc tym samym wyniki zliczeń na płytkach niedokładnymi. Innym częstym błędem jest wlewanie roztopionego agaru, gdy jest on zbyt gorący, co powoduje śmierć wielu komórek bakteryjnych w próbce. Błąd ten również wpłynie na dokładność zliczeń na płytkach, dając wyniki, które niedoszacowują całkowitej liczby jednostek tworzących kolonie w próbce.

Technika posiewu powierzchniowego. Technika posiewu powierzchniowego jest analogiczna do metody posiewu wgłębnego pod względem użyteczności jako sposób przeprowadzania obliczeń liczby komórek żywych na płytce. Jednakże, ponieważ kolonie powstające w technice posiewu powierzchniowego są równomiernie rozłożone na powierzchni pożywki agarowej, komórki z poszczególnych kolonii można izolować i wykorzystywać w późniejszych manipulacjach eksperymentalnych (np. jako szczepionkę do posiewu kreskowego lub do hodowli w bulionie). Trzema powszechnymi zastosowaniami, w których technika posiewu powierzchniowego stanowi istotny element, są eksperymenty dotyczące wzbogacania, selekcji oraz przesiewania. we wszystkich trzech zastosowaniach pożądany typ komórek można oddzielić od mieszaniny, a następnie poddać dowolnej liczbie testów biochemicznych, fizjologicznych lub genetycznych.

Doświadczenie z wzbogacaniem polega na wysianiu kultury mieszanej na podłoże lub inkubowaniu szalek w warunkach środowiskowych, które sprzyjają wzrostowi tych mikroorganizmów w próbce, które wykazują pożądane właściwości metaboliczne, charakterystykę wzrostu lub zachowania. Strategia ta nie hamuje wzrostu innych organizmów, lecz prowadzi do zwiększenia liczby pożądanych mikroorganizmów w stosunku do pozostałych w kulturze. W związku z tym kolonie powstające na płytce do wzbogacania prawdopodobnie wykazują właściwości fenotypowe odzwierciedlające pożądany genotyp. Na przykład, jeśli celem jest wyhodowanie bakterii wiążących azot z próbki środowiskowej zawierającej mieszankę ponad 1000 różnych gatunków bakterii, to wysianie próbki na podłoże ubogie w azot spowoduje wzbogacenie populacji o te bakterie, które potrafią wytworzyć ten związek z atmosfery, wykorzystując możliwości metaboliczne zapewnione przez zestaw genów niezbędnych do wiązania azotu.

Eksperyment selekcyjny polega na wysianiu kultury mieszanej na podłoże, które umożliwia wzrost tylko tym komórkom, które posiadają konkretny gen lub zestaw genów. Ten rodzaj eksperymentu jest powszechny w laboratoriach biologii molekularnej podczas transformacji szczepów bakteryjnych plazmidami zawierającymi geny oporności na antybiotyki. Jeśli celem jest hodowla wyłącznie komórek rekombinowanych, czyli tych, które pomyślnie przyjęły plazmid, wysianie próbki na podłoże uzupełnione odpowiednim stężeniem antybiotyku pozwoli wyselekcjonować komórki wykazujące oporność na ten konkretny lek.

Eksperyment przesiewowy polega na wysianiu mieszanej kultury na podłoże umożliwiające wzrost wszystkich żywotnych komórek; jednak komórki o pożądanym genotypie można odróżnić od pozostałych na podstawie ich fenotypu. Ten typ eksperymentu jest powszechny w laboratoriach biologii molekularnej podczas przeprowadzania testów mutagenezy lub klonowania genów do plazmidów. Klasyczny przykład, przedstawiony na Rysunku 11, wykorzystuje gen lacZ kodujący β-galaktosydazę; enzym ten pozwala komórkom na metabolizowanie X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranosidu), który jest analogiem substratowym naturalnego substratu – laktozy. Rozszczepienie X-Gal przez β-galaktosydazę prowadzi do powstania nierozpuszczalnego niebieskiego produktu. Zatem, jeśli podłoże zawiera X-Gal, a na tym podłożu wysieje się próbkę zawierającą komórki z genem lacZ typu dzikiego (funkcjonalnym) lub zmutowanym (niefunkcjonalnym), to po inkubacji komórki typu dzikiego posiadające funkcjonalny gen lacZ pojawią się jako niebieskie kolonie, natomiast komórki zmutowane z niefunkcjonalnym genem lacZ wystąpią jako kolonie bezbarwne („białe”).

Problemem technicznym, który najczęściej pojawia się podczas nauki techniki wysiewu powierzchniowego, jest nierównomierne rozprowadzenie komórek na powierzchni agaru. Przy użyciu obrotowego stolika i szklanej wymazówki próbka może zostać wchłonięta zbyt szybko, w efekcie czego kolonie tworzą się jedynie w pobliżu centrum płytki. W przypadku zastosowania tzw. „metody Copacabana” szklane kuleczki są obracane zamiast wstrząsanych na powierzchni agaru. W konsekwencji wiele kolonii rozwija się wzdłuż zewnętrznej krawędzi płytki. W obu przypadkach wynikowy rozkład kolonii nie wykorzystuje w pełni dostępnej powierzchni, co może prowadzić do skupiania się komórek i wzrostu nakładających się na siebie kolonii, co z kolei sprawia, że obliczanie liczby kolonii staje się niedokładne, a rozróżnienie typów komórek niewykonalne.

Metoda nakładania miękkiego agaru. Do zliczania fagów można zastosować procedurę zbliżoną do metody wysiewu powierzchniowego stosowanej do zliczania kolonii bakterii. O ile w przypadku zliczania kolonii (cfu/ml) na powierzchni agaru wysiewa się od 30 do 300 komórek bakteryjnych, o tyle w celu zliczania placków (pfu/ml) od 100 do 400 zakaźnych cząsteczek faga miesza się z 10⁸ do 10⁹ komórek gospodarza w warstwie miękkiego agaru rozprowadzonej na powierzchni twardego agaru odżywczego. Jeśli nie wykazano inaczej, zazwyczaj przyjmuje się, że pojedyncza komórka bakteryjna dzieli się i tworzy duże skupisko genetycznie identycznych komórek, nazywane kolonią. Jak omówiono wcześniej, założenie to nie jest słuszne, gdy komórki rosną w grupach (np. w parach, tetradach, łańcuchach lub skupiskach) lub wykazują cechy wzrostu, takie jak obecność kapsułek, które utrudniają tworzenie pojedynczych kolonii. Podobne założenie przyjmuje się w przypadku tworzenia placków, uznając, że każdy plack reprezentuje aktywność pojedynczego faga. Stwierdzenie to jest prawdziwe tylko wtedy, gdy jeden fag infekuje jedną bakterię. Co dzieje się, gdy wiele cząsteczek faga infekuje jedną bakterię? Problem ten odnosi się do istotnego parametru statystycznego, który należy uwzględnić podczas przeprowadzania eksperymentów z fagami – wielokrotności zakażenia (MOI) – opisującej stosunek zakaźnych cząsteczek faga do liczby komórek gospodarza w próbce. Ponieważ niektóre komórki adsorbują więcej niż jeden fag, podczas gdy inne adsorbują tylko jeden lub żadnego, populację komórek gospodarza należy infekować przy niskim MOI (≤1), aby zminimalizować prawdopodobieństwo zakażenia komórki przez więcej niż jedną cząsteczkę faga. Zastosowanie jednostki tworzącej plack (pfu) jako definicji funkcjonalnej pozwala uniknąć tych komplikacji podczas zliczania placków w celu obliczenia miana zapasu faga.

Jak pokazano na Rysunku 12, morfologia plamków różni się w zależności od faga. Niektóre fagi tworzą małe plamki (panel A), podczas gdy inne dają początek dużym plamkom (panel B). Na wielkość plamki wpływa szereg zmiennych. Istnieją techniczne przyczyny przyczyniające się do tej zmienności. Na przykład pożywki pełne oraz gruba, twarda agar wspierają powstawanie większych plamków, ponieważ komórki gospodarza mogą podtrzymywać wzrost faga przez dłuższy czas. Wysoka gęstość wysiewu komórek gospodarza (>10⁹ cfu na płytkę) spowoduje zmniejszenie wielkości plamki. Stosowanie niższych stężeń agaru miękkiego zwiększy szybkość dyfuzji cząsteczek faga w agarze miękkim, a tym samym zwiększy rozmiar plamków. Należy pamiętać, że ta zwiększona szybkość dyfuzji może wystąpić nieumyślnie, jeśli płytki z twardym agarem nie są całkowicie suche, co prowadzi do tego, że kondensacja lub nadmiar wilgoci w naczyniu rozcieńcza agar miękki w warstwie wierzchniej. To przeoczenie techniczne spowoduje niespójne wyniki w odniesieniu do wielkości plamki dla konkretnego faga.

Wielkość plamki jest również związana z szeregiem zdarzeń w komórce gospodarza, w tym z wydajnością adsorpcji, czasem trwania okresu latentnego (odstęp czasu od adsorpcji faga do lizy komórki gospodarza) oraz wielkością wyrzutu (liczbą potomstwa uwalnianego podczas pojedynczej infekcji). Jeśli cząsteczki fagowe infekują komórki gospodarza w różnych fazach wzrostu bakterii, można zaobserwować heterogeniczną mieszankę wielkości plamek. Na przykład te, które adsorbują w wczesnej fazie wykładniczej, tworzą większe plamki z większą liczbą fagów potomnych niż te, które adsorbują w późnej fazie wykładniczej. Co do zasady, fagi lityczne tworzą plamki przejaśnione, podczas gdy fagi lizogenne tworzą plamki mętne. Jednak niektóre fagi lityczne tworzą interesujące wzory, takie jak plamka typu „wole oko” pokazana na Ryc. 12B. Te przejaśnione plamki są otoczone mętnym halo, ponieważ komórki na krawędzi plamki nie ulegają całkowitej lizie lub mogą być oporne na infekcję fagową. Wzór „wolego oka” obserwowany u fagów umiarkowanych to plamka z mętnym centrum otoczonym przejaśnionym pierścieniem. Taka morfologia odzwierciedla MOI oraz fizjologię komórki gospodarza w odniesieniu do decyzji o lizie lub lizogenii. Gdy komórki są po raz pierwszy infekowane fagami, MOI jest niskie, a komórki szybko rosną ze względu na obfitość składników odżywczych; te czynniki wspólnie sprzyjają wzrostowi litycznemu. W miarę jak coraz więcej komórek ulega lizie, MOI wzrasta i tworzy się przejaśniona plamka. Jednak lizogeny w centrum plamki nadal rosną, ponieważ są odporne na lizę, co prowadzi do powstania przejaśnionej plamki z mętnym centrum.

Technikę nakładki można zmodyfikować w celu przeprowadzenia testów płytkowych z wirusami eukariotycznymi. Podobnie jak bakteriofagi tworzą płytki na trawniku komórek bakteryjnych w miękkim agarze, tak wirusy eukariotyczne tworzą płytki na monowarstwie komórek pokrytej żelem. Monowarstwa to konfluenta warstwa komórek rosnących obok siebie na powierzchni naczynia hodowlanego, stykających się ze sobą, lecz nie przerastających się wzajemnie. Aby przeprowadzić tego typu test płytkowy, do podatnych monowarstw komórek eukariotycznych dodaje się aliquoty wirusa. Następnie monowarstwę pokrywa się pożywką opartą na agarozie – żel ten ogranicza rozprzestrzenianie się potomnych wirusów uwalnianych z zainfekowanych komórek do sąsiednich komórek w monowarstwie. W efekcie powstaje kolisty obszar, czyli płytka, zawierający komórki uszkodzone w wyniku uwalniania wirionów. Aby ułatwić wizualizację płytek, do hodowli komórkowej można zastosować barwniki barwiące żywe komórki, co zapewnia kontrast między komórkami zainfekowanymi a niezainfekowanymi.

Technika nakładania miękkiego agaru jest stosowana w eksperymentach innych niż testy plackowe. Po pierwsze, należy pamiętać, że twardy agar odżywczy stanowi macierz wspierającą, która umożliwia wzrost bakterii. Po drugie, miękki agar stosowany do nakładki może mieć inny skład odżywczy niż agar twardy. W ten sposób miękki agar może służyć jako metoda badania szczepów bakteryjnych pod kątem różnych cech wzrostu lub właściwości metabolicznych. Na przykład technika nakładki jest wykorzystywana do przesiewania bakterii pod kątem zdolności do degradacji celulozy (Teather and Wood 1982). Pojedyncze kolonie hoduje się na nie selektywnym twardym podłożu agarowym, a następnie na powierzchnię twardego agaru nanosi się miękki agar zawierający 0,1% (w/v) karboksymetylocelulozy (CMC). Po inkubacji płytki zalewa się barwnikiem, który umożliwia wizualizację stref przejaśnienia wokół kolonii w miękkim agarze. Przejaśnienie jest spowodowane działaniem enzymów hydrolitycznych wydzielanych przez bakterie, które rozkładają celulozę w podłożu. W ostatnim czasie technika nakładki była stosowana do wykrywania bakterii hamujących wzrost archeonów metanogennych występujących w żwaczu zwierząt hodowlanych (Gilbert et al. 2010). Izolaty bakteryjne z próbek środowiskowych hoduje się na twardym podłożu agarowym, a następnie kolonie pokrywa się miękkim agarem zawierającym kulturę metanogenów. Po inkubacji płytki sprawdza się pod kątem występowania stref zahamowania wzrostu wokół kolonii. Metoda ta pozwala zidentyfikować szczepy bakteryjne produkujące inhibitory metanogenów w miękkim agarze.

Najczęstszymi błędami technicznymi występującymi przy zastosowaniu metody nakładki z miękkiego agaru są sytuacje, w których roztopiony miękki agar jest wlewany w temperaturze zbyt wysokiej lub zbyt niskiej. Jeśli temperatura jest zbyt wysoka, komórki bakteryjne zmieszane z podłożem zostaną zabite przed wysianiem. Jeśli temperatura jest zbyt niska, miękki agar podczas wlewania na twardy agar utworzy grudki. W obu przypadkach wyniki będą niejednoznaczne lub, w najlepszym razie, nieczytelne.

Procedura posiewu replikacyjnego. Przenoszenie kultur z jednego rodzaju pożywki na inną w celu zbadania wymagań wzrostowych staje się bardzo pracochłonne, gdy liczba szczepów jest większa niż kilka. Posiew replikacyjny jest metodą umożliwiającą jednoczesny screening dużej liczby mikroorganizmów. Na przykład, po mutagenizacji kultury komórek typu dzikiego, można wykonać posiewy rozcieńczeń kultury metodą rozlewania w celu uzyskania płytek z pojedynczymi koloniami. Płytki pierwotne zawierają pożywkę wspierającą wzrost wszystkich komórek, w tym prototrofów typu dzikiego, które syntetyzują wszystkie związki niezbędne do wzrostu, oraz mutantów aukstroficznych, które posiadają mutację genetyczną w szlaku biosyntezy, co uniemożliwia im syntezę określonych związków niezbędnych do wzrostu. Poprzez posiew mieszaniny komórek na pożywkę pełną, brakujące składniki odżywcze mogą zostać pobrane ze środowiska. Aby odróżnić prototrofy od aukstrofów, kolonie można powielić na pożywkę minimalną. Tylko prototrofy będą w stanie rosnąć. Ponieważ zachowany zostaje wzór przestrzenny płytki pierwotnej, porównanie płytki wtórnej z pierwotną pozwala na identyfikację kolonii mutantów. Aby ustalić, którego związku mutanty nie są już w stanie syntetyzować, kolonie można powielić na pożywki minimalne uzupełnione o konkretne związki (np. aminokwasy, źródła węgla, witaminy itp.). W ten sposób, stosując procedurę posiewu replikacyjnego, można jednocześnie przebadać setki kolonii. Błędem technicznym, który może wystąpić, jest użycie zbyt wilgotnych płytek z agarem, co powoduje rozmazanie kolonii i zanieczyszczenie wszystkich kultur na płytce. Prowadzi to do uzyskania całkowicie niewiarygodnych wyników. Innym błędem technicznym jest wywieranie zbyt dużego nacisku podczas przenoszenia komórek z weluru na płytki wtórne. Ponownie, po inkubacji płytek wtórnych, powstałe kolonie mogą na siebie nachodzić, tworząc fenotypy wzrostu przypisywane zanieczyszczeniu, a nie aukstrofii.

Nie wszystkie dzikie szczepy mikroorganizmów są prototrofami, dlatego procedurę płyt replikacyjnych można wykorzystać do jednoczesnego przesiewania różnych szczepów typu dzikiego pod kątem charakterystycznych wymagań wzrostowych. Jak pokazano na Rysunku 13, „odciski” komórek z czterech różnych szczepów bakterii Pseudomonas naniesiono w dubletach na płytkę z naniesioną siatką, zawierającą pełną pożywkę zwaną YTA (panel A). Następnie szczepy te zreplikowano na trzy płytki wtórne (panele B, C i D) składające się z pożywki minimalnej (MSA) uzupełnionej o różne źródła węgla (odpowiednio: acetamid, laktozę i glicynę). Wyniki wykazują, że dwa z czterech szczepów Pseudomonas (P. aeruginosa oraz P. stutzeri) nie są w stanie rosnąć na tych trzech źródłach węgla. W ramach kontroli szczepy zreplikowano na czwartą płytkę z pożywką YTA, aby potwierdzić, że komórki zostały przeniesione w trakcie całej procedury. Ponieważ wszystkie cztery szczepy rosną na kontrolnej płytce YTA, deficyty wzrostu zaobserwowane na trzech poprzednich płytkach w serii są wiarygodne. Wyniki replikacji na płytkach przedstawiono w Tabeli 1. Częstym błędem jest interpretowanie odcisku wzrostu na płytce wtórnej jako wyniku pozytywnego. Na przykład należy porównać fenotyp P. aeruginosa z fenotypem P. stutzeri na MSA+acetamid (panel B). Ten drugi wykazuje odcisk wzrostu, co jest wynikiem negatywnym i może wystąpić, jeśli składniki odżywcze z poprzedniej płytki zostaną przeniesione wraz z komórkami macierzystymi. Nie dochodzi do nowego wzrostu komórek, ponieważ brakujące składniki odżywcze nie są dostępne dla komórek potomnych. Łatwo pomylić odcisk z rzeczywistym wzrostem. W razie wątpliwości eksperyment należy powtórzyć, stosując alternatywną metodę, taką jak posiew smugowy komórek z płytki pierwotnej na pożywki wtórne.

Rycina 1. Przykład pojedynczych kolonii na płytce. Różowe sfery w pobliżu centrum płytki to kolonie Serratia marcescens, Gram-ujemnej, pałeczkowatej proteobakterii z rodziny Enterobacteriaceae. Ze względu na preferencję wilgotnych środowisk, mikroorganizm ten często występuje w narożnikach wanien, w umywalkach, w fugach między płytkami oraz na zasłonach prysznicowych. S. marcescens jest łatwo rozpoznawalna, ponieważ produkuje czerwony pigment zwany prodigiozyną. Kolonie na tej płytce uzyskano metodą posiewu kreskowego; pojedyncze kolonie pojawiły się w czwartym kwadrancie po inkubacji w 30 °C przez 24 godziny. Pozostałe trzy kwadranty wykazują wzrost zlewnej, w której komórki naniesione na powierzchnię agaru przekształciły się w nakładające się na siebie kolonie.

Rysunek 2. Instrumenty stosowane w metodzie posiewu kreskowego. Od góry do dołu przedstawiono wykałaczki (spłaszczone, nie okrągłe), pętlę z drutu, jednorazową pętlę plastikową oraz drewniane patyczki. Wykałaczki zazwyczaj przenosi się do małego zlewki szklanej szerokim końcem do dołu, a następnie przykrywa folią przed sterylizacją w autoklawie przed użyciem. Drewniane patyczki przenosi się do probówek 18 mm, a następnie sterylizuje w autoklawie przed użyciem.

Rysunek 3. (A) Technika posiewu smugowego z wykorzystaniem metody kwadrantowej. Do rozprowadzenia próbki na jednej czwartej powierzchni agaru używa się uprzednio wysterylizowanej pętli, patyczka lub wykałaczki, wykonując szybkie, płynne ruchy w przód i w tył od krawędzi do środka płytki. Czynność tę powtarza się dla każdego z czterech kwadrantów płytki. Po inkubacji wzrost komórek pojawia się wzdłuż ścieżki narzędzia użytego do naniesienia komórek na płytkę. Mechaniczne rozdzielenie komórek w próbce mieszanej przy użyciu tej techniki powinno skutkować powstaniem pojedynczych kolonii w czwartym kwadrancie (przykład przedstawiono na Rysunku 1). Pojedyncze kolonie określa się jako jednostki tworzące kolonie (cfu). (B) W przypadku użycia metalowej pętli do posiewu smugowego, należy ją wysterylizować w płomieniu palnika Bunsena przed kontaktem z inokulum lub podłożem agarowym. Należy pamiętać, że najgorętszą częścią płomienia jest wierzchołek niebieskiego stożka. Trzymając uchwyt narzędzia, należy umieścić drut w płomieniu w odległości około 3-4 cali od pętli. Pozostawić go tam na czas wystarczający do rozgrzania drutu do czerwoności. Przesunąć drut tak, aby płomień zbliżył się do pętli. Należy upewnić się, że metalowa pętla ostygła przed dotknięciem inokulum.

Rycina 4. Metoda podlewkowa. (A) Mała objętość próbki (od 0,1 do 1,0 ml) jest aseptycznie przenoszona do pustej, ale sterylnej szalki Petriego za pomocą pipety serologicznej o pojemności 5,0 ml. (B) Roztopiony agar, wyrównany do temperatury około 48 °C, jest następnie wlewany do szalki Petriego z próbką. Po zamknięciu pokrywy szalkę delikatnie obracano, aby wymieszać próbkę z roztopionym agarem. Pozostawia się agar do stężenia przez około 30 minut, a następnie szalki odwraca się do inkubacji.

Rycina 5. Metoda posiewu rozlewnego z wykorzystaniem obrotowego stolika i szklanego rozpylacza. Po umieszczeniu płytki z agarem na stoliku obrotowym, niewielką objętość próbki (0,1 do 0,2 ml) nanosi się aseptycznie na środek płytki za pomocą mikropipety. Rozpylacz sterylizuje się poprzez zanurzenie w zlewce z etanolem, a następnie przeprowadzenie go przez płomień palnika Bunsena w celu odpalenia nadmiaru etanolu. Przed kontaktem z próbką rozpylacz należy schłodzić, dotykając go agaru w pobliżu krawędzi płytki. Rozpylaczem delikatnie przesuwamy próbkę w przód i w tył po całej płytce podczas powolnego obracania się stolika. Czynność ta pozwala na stopniowe i równomierne rozprowadzenie próbki po powierzchni agaru. Po zamknięciu pokrywy płytkę należy pozostawić nieruchomo na blacie przez co najmniej 5 minut, aby próbka całkowicie wchłonęła się w agar przed odwróceniem płytki do inkubacji.

Rycina 6. Technika wysiewu powierzchniowego z użyciem szklanych kulek (metoda Copacabana). Wcześniej wysterylizowane w autoklawie szklane kulki wlewa się na powierzchnię szalki z agarem leżącej na blacie laboratoryjnym. Małą objętość próbki (100 do 150 μl) nanosi się aseptycznie na środek agaru za pomocą mikropipety. Przy zamkniętej pokrywie szalki wykonuje się poziome ruchy potrząsania, aby delikatnie przesuwać kulki w przód i w tył po szalce od 6 do 7 razy, rozprzestrzeniając próbkę. Czynność tę powtarza się po obróceniu szalki o 60°. Ruch potrząsania powtarza się po raz trzeci po kolejnym obrocie o 60°. Po całkowitym wchłonięciu próbki do podłoża agarowego kulki przelewa się do zlewki zawierającej 10% wybielacz. Następnie szalki odwraca się i poddaje inkubacji.

Rycina 7. Technika nakładki z miękkiego agaru stosowana do izolacji i enumeracji fagów na podstawie tworzenia placków (zwana również testem plackowym). (A) Obecność fagów można wykryć jako strefy przejaśnienia, czyli placki, na konfluentnej zawiesinie kolonii bakteryjnych rosnących w miękkim agarze. Fag T4 jest wirulentnym fagiem z dwuniciowym DNA, który infekuje swojego gospodarza, Escherichia coli, powodując lizę komórek gospodarza i uwalnianie potomstwa fagowego. Po wielu rundach infekcji i lizy, sąsiednie komórki E. coli w bezpośrednim sąsiedztwie pierwotnie zainfekowanej komórki gospodarza giną, pozostawiając plack zawierający miliardy cząsteczek faga T4. Fag T4 tworzy placki o średnicy około 1 mm. W tym doświadczeniu 200 μl rozcieńczenia 10^-5 zapasu faga T4 o stężeniu 2 x 10⁸ pfu/ml zmieszano z około 300 μl komórek wskaźnikowych E. coli przygotowanych jako hodowla w fazie wzrostu wykładniczego, napowietrzana w 37 °C. Zarówno fagi, jak i bakterie dodano do probówki z miękkim agarem EHA, wymieszano, a następnie wylano na powierzchnię płytki z twardym agarem EHA. Należy zauważyć, że w tym przypadku nie było konieczne dopuszczenie do adsorpcji fagów na bakteriach przed wysianiem na płytki. Po pozostawieniu miękkiego agaru do zastygnięcia przez 20 minut, płytki odwrócono i inkubowano w 37 °C przez 24 godziny. (B) W przypadku braku infekujących cząsteczek fagów, wzrost bakterii skutkuje mętną zawiesiną komórek w miękkim agarze, w której nie są widoczne pojedyncze kolonie. Zamiast tego, w całej warstwie miękkiego agaru tworzy się równomierny trawnik komórek bakteryjnych, w tym przypadku E. coli.

Rycina 8. Przygotowanie płytki pierwotnej (matki) z próbkami bakterii. Aby zachować porządek w próbkach, dno płytki można podzielić na siatkę i ponumerować powstałe kwadraty. Każdej próbce można przypisać konkretny kwadrat na siatce. Przedstawiono przykłady prawidłowych oraz nieprawidłowych wzorów szczepienia. W idealnym przypadku niewielka liczba komórek jest przenoszona do centrum kwadratu za pomocą sterylnego narzędzia do szczepienia, np. wykałaczki, aby „odstukać” próbkę (komórka nr 4). Częste błędy podczas szczepienia, takie jak te przedstawione w komórce nr 5 („plama”) i komórce nr 6 („wypełnienie”), prowadzą do nadmiernego rozrostu próbek bakterii po inkubacji, co w konsekwencji zanieczyszcza sąsiednie kwadraty.

Rysunek 9. Technika replikacji płytek stosowana do przenoszenia komórek z płytek pierwotnych na wtórne w celu przesiewania fenotypowego. Znacznik na płytce pierwotnej zostaje wyrównany ze znacznikiem na bloku pokrytym welurem, a następnie obniżony, aby powierzchnia agaru zetknęła się z tkaniną. Komórki są przenoszone z płytki na welur poprzez lekkie, ale równomierne dociśnięcie płytki pierwotnej opuszkami palców. Działanie to pozostawia odcisk próbek komórek na welurze w tym samym układzie przestrzennym, co na płytce pierwotnej. Ta sama procedura jest stosowana do przenoszenia komórek z weluru na płytkę wtórną. Z jednego odcisku płytki pierwotnej na welurze można zaszczepić od 7 do 8 płytek wtórnych. Ostatnia płytka zaszczepiona z weluru powinna służyć jako kontrola pozytywna. Powinno to być podłoże wspierające wzrost wszystkich badanych szczepów, co zapewni, że w całej serii płytek nastąpił wystarczający transfer komórek. Po inkubacji płytki wtórne można poddać inspekcji i ocenie pod kątem wzrostu lub braku wzrostu. W ten sposób wiele szczepów bakteryjnych może być przesiewanych jednocześnie na kilku podłożach wzrostowych w ramach jednego eksperymentu.

Rycina 10. Przykładowy wynik z zastosowaniem metody wlewania agaru. 1,0 ml próbki wody pobranej z publicznego ujęcia wody pitnej odmierzono do sterylnej, pustej szalki Petriego. Następnie do szalki z próbką wlano roztopioną, ale schłodzoną pożywkę YTA. Agar zawierał również 100 μg/ml cykloheksymidu, aby zapobiec wzrostowi drożdżaków i pleśni, które mogły znajdować się w próbce wody. Po delikatnym wymieszaniu przez obracanie, szalkę ustawiono na płaskiej powierzchni i pozostawiono do całkowitego zastygnięcia agaru. Szalkę inkubowano w temperaturze 37 °C przez 48 godzin. Przedstawiono wynik tego doświadczenia. Należy zwrócić uwagę na różnicę w wyglądzie kolonii powierzchniowych, które są duże i okrągłe, w porównaniu do kolonii podpowierzchniowych, które są bardzo małe i mają nieregularny kształt, ponieważ zastygłe podłoże hamuje rozprzestrzenianie się kolonii pod powierzchnią.

Rycina 11. Przykład wyniku z zastosowaniem metody wysiewu powierzchniowego. Do wysiewania mieszaniny komórek E. coli w eksperymencie przesiewowym wykorzystano „metodę Copacabana”. W tym przypadku pożywka wzrostowa (LB) zawiera X-Gal, zatem komórki wykazujące ekspresję funkcjonalnego enzymu β-galaktozydazy tworzą niebieskie kolonie, natomiast komórki z mutacją w genie lacZ, a tym samym niezdolne do ekspresji funkcjonalnej β-galaktozydazy, tworzą kolonie białe. Dwa typy kolonii, w ramach tzw. „przesiewu niebiesko-białego”, można łatwo od siebie odróżnić na tej samej płytce.

Rysunek 12. Przykładowy wynik testu plackowego z wykorzystaniem techniki nakładki z miękkiego agaru. Przedstawiono plaki utworzone na szczepie gospodarza Mycobacterium smegmatis mc²155 (ATCC 700084) przez dwa różne fagi: (A) mycobacteriofaga Destroyers oraz (B) mycobacteriofaga MSSS. Fagi te zostały wyizolowane przez studentów podczas kursu laboratoryjnego MIMG 103L na UCLA wiosną 2010 roku. M. smegmatis jest niepatogenną bakterią z rzędu Actinobacterium i należy do rodziny prątków, która obejmuje kilka patogenów znanych z wywoływania poważnych chorób, takich jak gruźlica (M. tuberculosis, M. africanum, M. bovis) i trąd (M. leprae). Około 50 μl rozcieńczenia 10^-2 Destroyers oraz 10^-3 MSSS inkubowano z 500 μl M. smegmatis przez 20 minut w 37 °C, a następnie zmieszano z MBTA (miękki agar) i wylano na płytki z MHA (twardy agar). Po pozostawieniu miękkiego agaru do zastygnięcia przez 20 minut, płytki odwrócono i inkubowano w 37 °C przez 48 godzin. Należy zwrócić uwagę na wyraźne różnice w morfologii placków tworzonych przez każdy z fagów. Destroyers (A) tworzy małe (średnica średnia około 1 mm), przejrzyste plaki charakterystyczne dla faga litycznego, natomiast MSSS (B) rozwija duże plaki typu „wole oko” z przejrzystymi centrami otoczonymi mętnym halo (średnica średnia około 3,2 mm). Zamglony pierścień może składać się z bakterii opornych na infekcję fagową. Wzór ten różni się od tworzonego przez fagi lizogenne, które produkują plaki mętne.

Rycina 13. Przykład wyniku z zastosowaniem procedury przesiewania (metody replikacji). Cztery szczepy Pseudomonas (P. aeruginosa, P. putida, P. fluorescens i P. stutzeri) przetestowano w dubletach pod kątem wzrostu na trzech różnych źródłach węgla: acetamidzie, laktozie i glicynie. (A) Płytka pierwotna to pożywka pełna (YTA) zaszczepiona czterema wskazanymi szczepami. Po inkubacji w 30 °C przez 24 godziny wszystkie cztery szczepy urosły na YTA. Płytka pierwotna posłużyła do wykonania replikacji na pożywkę minimalną (MSA) uzupełnioną o pojedyncze źródło węgla: acetamid (B), laktozę (C) i glicynę (D). Ostatnią płytką w serii była płytka kontrolna dodatnia YTA (E). Jak pokazano, szczepy wykazują zróżnicowane wzorce wzrostu po inkubacji na płytkach wtórnych. Należy zauważyć, że czasami trudno jest odróżnić wzrost od odcisku komórek. Na przykład, porównując odcisk pozostawiony przez P. stutzeri na trzech płytkach MSA z brakiem wzrostu P. aeruginosa na tych samych trzech płytkach. Oba wyniki są ujemne w porównaniu do wzorców wzrostu wykazanych przez P. putida i P. fluorescens. Jednak wszystkie szczepy urosły na płytce kontrolnej dodatniej, co potwierdza, że komórki zostały przeniesione na wszystkie płytki wtórne w serii. Wyniki tego eksperymentu zestawiono w Tabeli 1.

	YTA (podłoże podstawowe)	MSA + acetamid	MSA + laktoza	MSA + glicyna	YTA (kontrola)
P. aeruginosa	+	-	-	-	+
P. putida	+	+	+	+	+
P. fluorescens	+	+	+	+	+
P. stutzeri	+	-	-	-	+

Tabela 1. Podsumowanie wyników przesiewania metodą replica plating. Wzrost oznaczono znakiem plus (+), a brak wzrostu znakiem minus (-). YTA to pożywka kompletna (agar z tryptonem drożdżowym), a MSA to pożywka minimalna (agar z minimalną ilością soli). Pożywki MSA zostały uzupełnione o pojedyncze źródło węgla, zgodnie z oznaczeniami.

Dyskusja

Hodowla mikroorganizmów obejmuje szereg metod posiewu, z których wszystkie wymagają zachowania techniki aseptyki podczas manipulacji komórkami i pożywkami. W protokole tym opisano pięć różnych procedur. Chociaż te techniki powlekania są rutynowo stosowane do manipulowania bakteriami i fagami, można je również stosować do hodowli komórek ssaków i mikroorganizmów eukariotycznych powszechnie stosowanych w genetyce molekularnej, takich jak drożdże (tj. Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Schizosaccharomyces pombe), glony i pierwotniaki (tj. Volvox, Chlamydomonas, Amoeba, Paramecium) oraz nicienie (tj. Caenorhabditis elegans). Istnieją również liczne (i jeszcze bardziej wyrafinowane) warianty każdej metody posiewu, w zależności od celu eksperymentalnego lub badanego organizmu. Dlatego ważne jest, aby nie tylko wybrać najbardziej odpowiednią technikę dla danego eksperymentu lub docelowego mikroorganizmu, ale także dostosować metodologię tak, aby wyniki eksperymentu odpowiednio odpowiadały na pytanie lub problem badawczy.

Niektóre z najnowszych zastosowań technik powlekania omówionych w tym protokole obejmują postęp technologiczny, który zapewnia wyniki o wysokiej przepustowości w badaniach przesiewowych i eksperymentach związanych z odkrywaniem leków. Na przykład centra sekwencjonowania genomu wykorzystują "metodę Copacabana" do rozprzestrzeniania bibliotek klonów, które są komórkami E. coli przekształconymi plazmidami zawierającymi fragmenty DNA pochodzące z genomu mikroorganizmu. Ponieważ jednorazowo przygotowywane są dziesiątki dużych płytek (zwanych tacami do testów biologicznych), do wytrząsania szklanych kulek dla całej partii tacek używa się automatycznej wytrząsarki do płytek. Ponadto, podczas selekcji kolonii z tych płytek po inkubacji, do zbierania komórek z odpowiednich kolonii jako inokulum dla bulionu LB w 384-dołkowych mikropłytkach używa się robotycznego zbieracza kolonii. W przypadku tego wysokoprzepustowego testu przesiewowego zastosowanie mają zasady proceduralne techniki płytki rozsiewającej, ale technologia pozwala na automatyzację i skalowanie różnych etapów, aby umożliwić jednoczesną analizę dużej liczby próbek w krótkim czasie.

Firmy biotechnologiczne i farmaceutyczne inwestują znaczne środki w rozwój wysokoprzepustowej technologii dla najbardziej podstawowych technik w mikrobiologii i genetyce molekularnej. Na przykład istnieją wielokanałowe mikropipetory do przenoszenia objętości do 8 lub 12 próbek jednocześnie. Istnieją nawet zrobotyzowane stacje robocze, które manewrują 96-kanałową głowicą pipetową! Wysiłki te obejmują multidyscyplinarne zespoły naukowców, łączące biologów posiadających wiedzę metodologiczną z inżynierami i programistami komputerowymi, którzy mogą opracować oprzyrządowanie potrzebne do wykonywania operacji mechanicznych związanych z eksperymentami. Niezależnie od zastosowania badawczego, cel wspólny dla firm rozwijających te technologie jest taki sam – automatyzacja procesów laboratoryjnych, narzędzi, systemów i przyrządów, czyniąc je mniej pracochłonnymi i bardziej wydajnymi.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
1. Agar z tryptonem drożdżowym (YTA) < treść>
Ekstrakt drożdżowy	2.0 g
Trypton	10.0 g
Agar
Woda destylowana	do 1000,0 ml
	pH 7,0
NH4Cl	1.0 g
NH2HPO4• 2H2O	2.14 g
KH2PO4	1,09 g
MgSO4• 7H2O	0,2 g
Źródło węgla*	1.0 g
Roztwór soli śladowych**	10.0 ml
Agar
Woda destylowana	do 1000,0 ml
	pH 7,0
FeSO4• 7H2O	300,0 mg
MnCl2• 4H2O	180,0 mg
Co(NO3)2• 6H2O	130,0 mg
ZnSO4.7H2O	40,0 mg
H2MoO4	20,0 mg
CuSO4• 5H2O	1,0 mg
CaCl2	1000,0 mg
HCl (0,1 N)	do 1000,0 ml
Agar
	Trypton	13.0 g
	NaCl	8.0 g
	Na Cytrynian&byk; 2H2O	2.0 g
	Glukoza
	Woda destylowana	do 1000,0 ml
Agar	12.0 g
Trypton	13.0 g
NaCl
Na Cytrynian&byk; 2H2O
Glukoza
Woda destylowana	do 1000,0 ml
100 mM CaCl2 stock*	1 ml
7H9 płynne medium: Neat **	50 ml
2XTA ***	50 ml
7H9 baza bulionowa
40% zapasów glicerolu	5 ml
Woda destylowana	do 900,0 ml
7H9 baza bulionowa
Agar	1.0 g
Woda destylowana	do 1000.0 ml
7H10 baza agarowa
40% zapasów glicerolu	12,5 ml
Woda destylowana	887.5 ml
AD (wstępnie podgrzany do 37° C)*	100 ml
50 mg/ml karbenicyliny **	1,0 ml
10 mg/ml cykloheksymidu **	1,0 ml
NaCl >	17 g >
Albumina (frakcja V)>	100 g>
Dekstroza (D-glukoza)>	40 g>
Woda destylowana>	do 2000.0 ml>
Trypton	10.0 g
Ekstrakt drożdżowy
NaCl	10.0 g
Agar
Woda destylowana	do 1000,0 ml
	pH 7,5 przy 25° C
Nazwa odczynnika	Company	Numer katalogowy
Ekstrakt drożdżowy	Becton Dickenson	212750
Trypton	Becton Dickenson	211705
Agar	Becton Dickenson	214030
NH4Cl	Acros Organics	123340010
NH2HPO4• 2H2O	Sigma-Aldrich	30435
KH2PO4	Fisher Naukowy	BP 303-500
MgSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	230391
Acetamid	Sigma-Aldrich	A-0500
Laktoza	Fisher Scientific	L6-500
Glicyna	Sigma-Aldrich	G-7126
FeSO4• 7H2O	Sigma-Aldrich	F8048
MnCl2• 4H2O	Sigma-Aldrich	M-3634
Co(NO3)2• 6H2O	Sigma-Aldrich	230375
ZnSO4.7H2O	Sigma-Aldrich	Z4750
H2MoO4	Acros Organics	213621000
CuSO4• 5H2O	Sigma-Aldrich	209198
CaCl2	Sigma-Aldrich	C1016
HCl	Fisher Naukowy	A144-212
Cykloheksymid	Sigma	038K1561
karbenicylina	Cellgro	46-100-RG
NaCl	Fisher	S271-1
Na Cytrynian&byk; 2H2O	Fisher	S279-500
Glukoza (dekstroza)	BD	215530
7H9 baza bulionowa	BD	271310
7H10 baza agarowa	BD	262710
Glycerol	Shelton	IB15760
Albumina (frakcja V)	Fisher	S71907
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galaktopyranozyd)	Teknova	X1205
dimetyloformamid (DMF)	Sigma	D4551
Etanol	Fisher	CDA19
Wybielacz chlorowy	Chlorox	02490/06644884
CiDecon (środek dezynfekujący)	Decon Laboratories, Inc.	8504
Nazwa sprzętu	Company	Numer katalogowy	Eksperyment
Metalowe pętle	Amerykańskie produkty edukacyjne	S17352	Powłoka smugowa
Jednorazowe plastikowe pętle	Fisher	22-363-602	Powłoka smugowa
Drewniane kije	Fisher	23-400-104	Powłoka smugowa
Wykałaczki płaskie	Amerykańskie produkty edukacyjne	S67859	Powłoka smugowa
Stoły obrotowe	Fisher	08-758Q	Powłoka rozsiewająca
pręty szklane	Bellco Glass	NC9004380	Powłoka rozsiewająca
4 mm	Fisher	11-312B	Powłoka rozsiewająca
Aksamitna ściereczka	Produkty Bel-Art	09-718-2	Replika poszycia
Blok cylindryczny	Produkty Bel-Art	09-718-1	Replika poszycia