Bioinżynieria ludzkich sieci mikro naczyniowych u myszy z niedoborem odporności

Podsumowanie

W niniejszej pracy opisujemy metodologię podskórnego wprowadzania do myszy z niedoborem odporności ludzkich komórek endotelialnych tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej oraz mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z szpiku kostnego, osadzonych w żelu kolagenowo-fibronektynowym. Ta kombinacja komórek i żelu generuje ludzką sieć naczyniową, która łączy się z układem naczyniowym myszy.

Streszczenie

Przyszłość inżynierii tkankowej i terapii komórkowych w regeneracji tkanek będzie prawdopodobnie zależeć od naszej zdolności do generowania funkcjonalnych sieci naczyniowych in vivo. W związku z tym poszukiwanie modeli eksperymentalnych służących do budowy sieci naczyń krwionośnych in vivo ma kluczowe znaczenie ¹. Wykonalność bioinżynierii mikrovascularnych sieci in vivo wykazano po raz pierwszy z wykorzystaniem dojrzałych komórek śródbłonka (ECs) pochodzących z ludzkich tkanek ^2-4; jednak takie autologiczne komórki śródbłonka stwarzają problemy w szerokim zastosowaniu klinicznym, ponieważ trudno je pozyskać w wystarczających ilościach i wymagają one pobrania z istniejących naczyń. Ograniczenia te skłoniły do poszukiwania innych źródeł ECs. Identyfikacja komórek śródbłonka tworzących kolonie (ECFCs) we krwi stworzyła możliwość nieinwazyjnego pozyskiwania ECs ^5-7. My oraz inni autorzy wykazaliśmy, że ECFCs pochodzące z krwi obwodowej dorosłych oraz z krwi pępowinowej mają zdolność do tworzenia funkcjonalnych sieci naczyniowych in vivo ^7-11. Co istotne, badania te wykazały również, że w celu uzyskania stabilnych i trwałych sieci naczyniowych, ECFCs wymagają współimplantacji z komórkami okołonaczyniowymi. Opisany tutaj test ilustruje tę koncepcję: pokazujemy, w jaki sposób ludzkie ECFCs pochodzące z krwi pępowinowej mogą być łączone z mezenchymalnymi komórkami macierzystymi (MSCs) pochodzącymi z szpiku kostnego w postaci pojedynczej zawiesiny komórkowej w żelu kolagen/fibronektyna/fibrynogen, aby utworzyć funkcjonalną ludzką sieć naczyniową w ciągu 7 dni po implantacji do myszy z niedoborem odporności. Obecność wyścielonych ludzkimi ECFCs światw zawierających erytrocyty gospodarza jest widoczna w całych implantach, co wskazuje nie tylko na formowanie (de novo) sieci naczyniowej, ale także na rozwój funkcjonalnych anastomoz z układem krążenia gospodarza. Ten mysi model bioinżynieryjnej ludzkiej sieci naczyniowej jest idealnie dostosowany do badań nad komórkowymi i molekularnymi mechanizmami tworzenia ludzkiej sieci naczyniowej oraz do opracowywania strategii unaczyniania tkanek inżynieryjnych.

Protokół

1. Przygotowanie

1. Przygotowanie pożywki EGM-2 (500 mL)
   • Do 395 mL podstawowej pożywki dla komórek śródbłonka (EBM-2) dodać 100 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   • Dodać 5 mL 100x roztworu glutaminy, penicyliny i streptomycyny (GPS).
   • Dodać wszystkie suplementy z zestawu EGM-2 SingleQuots z wyjątkiem hydrokortyzonu (tzn. VEGF, hFGF-B, R-IGF-1, hEGF, heparynę, kwas askorbinowy i GA-1000).
   • Zsterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 0,2 µm.
2. Przygotowanie pożywki MSCGM (500 mL)
   • Do 440 mL podstawowej pożywki dla mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCBM) dodać 5 mL 100x GPS.
   • Dodać całą zawartość zestawu MSCGM SingleQuots.
   • Dodać alikwot hFGF-B z suplementów EGM-2 SingleQuots.
   • Zsterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 0,2 µm.
3. Przygotowanie pożywki DMEM (500 mL)
   • Do 440 mL 1x pożywki Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) z wysoką zawartością glukozy dodać 50 mL płodowej surowicy bydlęcej (FBS).
   • Dodać 5 mL 100x GPS.
   • Dodać 5 mL roztworu nieessentialnych aminokwasów.
   • Zsterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 0,2 µm.
4. Przygotowanie roztworu kolagenu/fibronektyny (3,6 mL; przygotować w dniu iniekcji)
   • Do 150 µL destylowanej H₂O dodać 0,4 mL 10x DMEM.
   • Dodać 100 µL 1M HEPES (stężenie końcowe 25 mM).
   • Ostrożnie dodać 2,4 mL kolagenu bydlęcego (stężenie zapasu 5 mg/mL; stężenie końcowe 3 mg/mL) i delikatnie wymieszać w lodzie.
   • Dostosować pH do obojętnego poprzez dodanie roztworu 1N NaOH (około 30 µL).
   • Użyć wskaźnika czerwieni fenolowej do oceny obojętnego pH; alternatywnie można użyć papierka wskaźnikowego pH do monitorowania pH.
   • Dodać 120 µL ludzkiej fibronektyny (stężenie zapasu 1 mg/mL; stężenie końcowe 30 µg/mL).
   • Dodać 0,4 mL FBS (stężenie końcowe 10%).
   • Przechowywać roztwór w lodzie do momentu użycia.
5. Przygotowanie roztworu fibrynogenu (1 mL; przygotować w dniu iniekcji)
   • Do 1 mL roztworu 0,9N NaCl (pH 7,4) dodać 30 mg fibrynogenu w proszku (stężenie końcowe 30 mg/mL).
   • Przed użyciem inkubować roztwór fibrynogenu w temperaturze 37°C przez 30 minut.
   • Delikatnie wymieszać, bez użycia vortexa, przed dodaniem do żelu kolagenowego/fibronektynowego.
6. Przygotowanie roztworu trombiny (200 mL)
   • Do 200 mL soli fizjologicznej 0,9% NaCl dodać 1 KU trombiny w proszku (50 U/mL).
   • Zsterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra strzykawkowego o rozmiarze porów 0,2 µm i przechowywać w temperaturze -20°C do momentu użycia.
   • Przed użyciem rozcieńczyć solą fizjologiczną 0,9% NaCl do stężenia końcowego 10 U/mL.
7. Przygotowanie 1% roztworu żelatyny (500 mL)
   • Do 500 mL soli fizjologicznej z buforem fosforanowym Dulbecco (PBS) dodać 5 g żelatyny w proszku.
   • Autoklawować w temperaturze 121°C przez 30 min.
   • Zsterylizować poprzez filtrację za pomocą filtra próżniowego o rozmiarze porów 0,2 µm.
8. Powlekanie 100-mm płytek do hodowli tkankowych 1% roztworem powlekającym z żelatyny
   • Do każdej 100-mm płytki do hodowli tkankowej dodać 10 mL 1% roztworu żelatyny.
   • Inkubować płytki w temperaturze 37°C przez 60 min.
   • Przed użyciem usunąć roztwór żelatyny i jednokrotnie przemyć płytki PBS.

2. Hodowla ludzkich endotelialnych komórek tworzących kolonie (ECFCs) pochodzących z krwi pępowinowej

Protokół ten zakłada, że w laboratorium przed rozpoczęciem eksperymentu dostępne są zamrożone fiolki z ECFC. ECFC można wyizolować z frakcji komórek mononuklearnych krwi pępowinowej lub obwodowej osób dorosłych, zgodnie z wcześniejszym opisem ⁷.

1. Rozmrozić jedną fiolkę ECFC (zwykle 0,5-1x10⁶ komórek w 1 mL medium do mrożenia) wyjętą z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie i natychmiast rozcieńczyć jej zawartość w probówce stożkowej o pojemności 15 mL zawierającej 10 mL medium DMEM. Wirować przy 1200 rpm przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspender osad komórkowy w 10 mL ocieplonego medium EGM-2.
2. Przenieść 10 mL zawiesiny ECFC na jedną 100-mm płytkę do hodowli tkanek pokrytą 1% żelatyną. Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5%CO₂. Następnego dnia delikatnie odessać niezwiązane komórki oraz medium, a następnie dostarczyć związanym komórkom 10 mL świeżego medium EGM-2.
3. Wymieniać medium na płytce co 2-3 dni, stosując medium EGM-2. Pozostawić komórki do namnożenia, aż płytka zostanie pokryta konfluentną monowarstwą komórkową. Po osiągnięciu konfluencji przeprowadzić subkulturę komórek w następujący sposób:
4. Odessać medium hodowlane i przemyć komórki 10 mL PBS.
5. Usunąć PBS i dodać 2 mL roztworu trypsyny-EDTA do każdej płytki 100-mm. Delikatnie kołysać płytkami, aby równomiernie rozprowadzić roztwór trypsyny-EDTA. Inkubować w temperaturze 37°C i 5%CO₂ przez 3-5 minut. Delikatnie opukać płytkę, aby sprawdzić pod mikroskopem odwróconym, czy oddzielone komórki znajdują się w zawiesinie.
6. Gdy komórki całkowicie się oddzielą, dodać 8 mL medium EGM-2 i zebrać zawiesinę komórkową do probówki stożkowej o pojemności 15 mL. Pobrać 10 μL w celu policzenia komórek w komorze countingowej i obliczyć całkowitą liczbę zebranych komórek.
7. Wysiać komórki na płytki do hodowli tkanek pokryte 1% żelatyną z gęstością zasiewu 5,000 komórek/cm² przy użyciu medium EGM-2. Umieścić płytki w inkubatorze i dokarmiać je co 2-3 dni medium EGM-2.

Powtarzaj tę procedurę w kolejnych pasażach. Monitoruj numer pasażu w miarę powiększania populacji komórek. ECFC będą wykorzystywane pomiędzy 4. a 8. pasażem.

3. Hodowla mezenchymalnych komórek macierzystych (MSCs) pochodzących z ludzkiego szpiku kostnego

Protokół ten zakłada, że w laboratorium przed rozpoczęciem eksperymentu dostępne są zamrożone fiolki z ludzkimi MSC. MSC można wyizolować z aspiratów szpiku kostnego zgodnie z wcześniejszym opisem ¹¹.

1. Rozmrozić jedną fiolkę MSC (zazwyczaj 0,50-1x10⁶ komórek w 1 mL medium do mrożenia) wyjętą z pojemnika do przechowywania w ciekłym azocie i natychmiast rozcieńczyć jej zawartość w stożkowej probówce 15-mL zawierającej 10 mL medium DMEM. Wirować przy 1200 rpm przez 5 min. Usunąć nadsącz i resuspendować pellet komórkowy w 10 mL ogrzanego medium MSCGM.
2. Przenieść 10 mL zawiesiny MSC do jednej niepowlekanej płytki hodowlanej 100-mm. Umieścić płytkę w inkubatorze z nawilżaniem w temperaturze 37°C i 5%CO₂. Następnego dnia delikatnie odessać niezwiązane komórki i medium, a następnie dostarczyć związanym komórkom 10 mL świeżego medium MSCGM.
3. Dokarmiać płytkę co 2-3 dni medium MSCGM. Pozwolić komórkom na ekspansję, aż płytka osiągnie 80% konfluencji monowarstwy komórkowej. Przy 80% konfluencji przeprowadzić subkulturę komórek w następujący sposób:
4. Odessać medium hodowlane i przemyć komórki 10 mL PBS.
5. Usunąć PBS i dodać 2 mL roztworu trypsyny-EDTA do każdej płytki 100-mm. Delikatnie kołysać płytkami, aby równomiernie rozprowadzić roztwór trypsyny-EDTA. Inkubować w 37°C i 5%CO2 przez 3-5 minut. Delikatnie opukać płytkę, aby sprawdzić w mikroskopie odwróconym, czy odspojone komórki znajdują się w zawiesinie.
6. Gdy komórki całkowicie się odspoją, dodać 8 mL medium MSCGM i zebrać zawiesinę komórkową do stożkowej probówki 15-mL. Pobrać 10 μL w celu policzenia komórek w komorze countingowej (haemocytometrze) i obliczyć całkowitą liczbę zebranych komórek.
7. Wysiać komórki na niepowlekane płytki hodowlane z gęstością zasiewu 10 000 komórek/cm² przy użyciu medium MSCGM. Umieścić płytki w inkubatorze i dokarmiać je co 2-3 dni medium MSCGM.

Powtórz tę procedurę w kolejnych pasażach. Monitoruj numer pasażu w miarę namnażania populacji komórek. Komórki MSC będą wykorzystywane między 4. a 8. pasażem.

4. Resuspensja komórek w roztworze kolagenu/fibronektyny/fibrynogenu (dzień 0)

Przed rozpoczęciem eksperymentu należy upewnić się, że w hodowli znajduje się wystarczająca liczba ECFC oraz MSC; dla każdego implantu i myszy wymagane będzie 0.8x10⁶ ECFC oraz 1.2x10⁶ MSC.

1. Odssać pożywkę z każdej płytki hodowlanej i przemyć komórki 10 mL PBS. Usunąć PBS i dodać 2 mL roztworu trypsyny-EDTA do każdej płytki 100-mm. Delikatnie poruszać płytkami, aby równomiernie rozprowadzić roztwór trypsyny-EDTA. Inkubować przez 3-5 minut. Delikatnie opukać płytkę, aby sprawdzić pod mikroskopem odwróconym, czy oddzielone komórki znajdują się w zawiesinie.
2. Po całkowitym oddzieleniu komórek dodać 8 mL pożywki DMEM i zebrać zawiesinę komórkową do probówki stożkowej 15-mL. Pobrać 10 μL w celu policzenia komórek w komorze countingowej (hemocytometrze) i obliczyć całkowitą liczbę zebranych ECFC i MSC.
3. Przenieść 4x10⁶ ECFC (5x 0,8x10⁶ komórek) oraz 6x10⁶ MPC (5x 1,2x10⁶ komórek) wspólnie do jednej probówki stożkowej 50-mL. Jest to całkowita liczba komórek wymagana dla pięciu oddzielnych implantów i myszy. Wirować przy 1200 rpm i usunąć nadsącz.
4. Delikatnie dodać 100 uL roztworu fibrynogenu do 0,9 mL roztworu kolagenu/fibronektyny (końcowe stężenie fibrynogenu 3 mg/mL); przechowywać mieszaninę w lodzie.
5. Resuspender osad komórkowy w 1 mL lodowatego roztworu kolagenu/fibronektyny/fibrynogenu; mieszać komórki bardzo delikatnie, aby uniknąć powstania pęcherzyków powietrza. Nabrać mieszaninę do sterylnej strzykawki 1-mL i założyć igłę 26G z nakładką na końcówkę strzykawki. Przechowywać napełnioną strzykawkę w lodzie do momentu iniekcji.

5. Iniekcja u immunodeficyjnej myszy nude (dzień 0)

Wszystkie eksperymenty na zwierzętach zostaną przeprowadzone z wykorzystaniem 6-tygodniowych myszy athymic nude (nu/nu).

1. Przed iniekcją znieczuli myszy z niedoborem odporności, umieszczając je w komorze gazowej z izofluranem. Pozostaw myszy w oparach izofluranu przez około 2 minuty, aż zostaną znieczulone i przestaną reagować na ucisk palca (monitoruj tętno poprzez obserwację).
2. Każdej myszy wstrzyknij podskórnie 50 μL roztworu trombiny (10 U/mL) w górny region grzbietu, używając igły o rozmiarze 26G.
3. W to samo miejsce, w którym podano trombinę, wstrzyknij 200 μL mieszaniny komórek za pomocą igły o rozmiarze 26G. Kolagen zgeli w temperaturze 37°C, a fibrynogen utworzy żel fibrynowy w obecności trombiny. W rezultacie pod skórą powinien powstać niewielki, lecz zauważalny guzek.
4. Po iniekcji umieść myszy na warstwie gazy, aby zapewnić im komfort i ciepło, i obserwuj je do momentu odzyskania zdolności poruszania się. Następnie obserwuj myszy codziennie przez pierwsze trzy dni.

6. Zbiór (Dzień 7)

1. Tydzień po iniekcjach uśmierć myszy, umieszczając je w komorze gazowej z dostarczanym sprężonym gazem CO₂.
2. Po uśmierceniu nacinij skórę w pobliżu miejsca iniekcji i chirurgicznie usuń wkład żelowy. Zaleca się wykonanie cyfrowych zdjęć odzyskanych wkładów żelowych wraz ze skalą.
3. Umieść pobrane wkłady żelowe w kasetkach histologicznych i zanurz je w 10% neutralnie buforowanej formalinie na noc w temperaturze pokojowej.
4. Po utrwaleniu wypłucz 10% neutralnie buforowaną formalinę destylowaną H₂O i przechowuj kasetki histologiczne w temperaturze 4°C w PBS do czasu oceny histologicznej.

7. Ocena: histologia (H&E) i immunohistochemia (hCD31)

1. Do oceny histologicznej implanty zatapia się w parafinie i wykonuje ich przekroje (skrawki o grubości 7 μm) zgodnie ze standardowymi procedurami histologicznymi.
2. Ilościowo określ gęstość mikronaczyniową poprzez ocenę skrawków zabarwionych hematoksyliną i eozyną (H&E), pobranych z części środkowej implantów. Standardowe protokoły barwienia H&E są dostępne w innych źródłach. Mikronaczynia można zidentyfikować jako struktury światłowate zawierające erytrocyty. Gęstość mikronaczyniową należy podać jako średnią liczbę wypełnionych erytrocytami mikronaczyń z analizowanych pól, wyrażoną jako naczynia/mm².
3. Aby wykazać ludzkie pochodzenie naczyń mikrokrażeniowych, skrawki wyjętego implantu należy poddać barwieniu immunohistochemicznemu z użyciem przeciwciała specyficznego dla ludzkiego CD31 (hCD31) zgodnie ze standardowymi protokołami barwienia. Zalecamy stosowanie mysiego monoklonalnego przeciwciała anty-human CD31 firmy DakoCytomation (Klon JC70A; kat. # M0823) w rozcieńczeniu 1:100. Specyficzność tego przeciwciała względem ludzkich antygenów została potwierdzona poprzez negatywną reakcję uzyskaną na różnorodnych skrawkach tkanek mysich barwionych równolegle ^7,11. Należy zauważyć, że wewnątrz implantów (zwłaszcza wokół krawędzi) często widoczne są naczynia krwionośne myszy, jednak naczynia mysie nie wykażą pozytywnego barwienia z tym przeciwciałem. Dodatkowo obecność ludzkich MSC można wykryć poprzez barwienie immunohistochemiczne przeciwciałami specyficznymi dla ludzkiego CD90 lub α-aktyny mięśni gładkich (α-SMA). Ludzkie MSC znajdują się zarówno w regionie perywascularnym nowo powstałych naczyń krwionośnych, jak i w przestrzeniach śródmiąższowych w obrębie całego implantu ¹¹.

8. Reprezentatywne wyniki

Rycina 1. Typowy wygląd kultur ECFC i MSC. Mikrografie w kontraście fazowym przedstawiające typowy wygląd ECFC i MSC w kulturze. (A) Konfluencyjna monowarstwa ECFC pochodzących z krwi pępowinowej wykazująca charakterystyczną morfologię brukową komórek endotelialnych. (B) Ludzkie MSC pochodzące z szpiku kostnego wykazujące morfologię wrzecionowatą. Paski skali, 200 um.

Rycina 2. Wygląd eksplantowanych wtyczek w 7. dniu. ECFC pochodzące z ludzkiej krwi pępowinowej oraz MSC pochodzące z szpiku kostnego osadzono w żelu kolagenowo-fibronektynowo-fibrynowym i zaimplantowano podskórnie u myszy nago, zgodnie z opisem w tekście. (A) Po 7 dniach, po uśmierceniu myszy, należy rozciąć skórę w pobliżu miejsca wstrzyknięcia i odsłonić wtyczkę komórkowo-żelową, odchylając skórę. (B) Wygląd wtyczki chirurgicznie usuniętej z myszy przed utrwaleniem w formalinie. Czerwony kolor implantu świadczy o unaczynieniu.

Rycina 3. Histologiczna identyfikacja sieci naczyniowej w wyeksplantowanych wkładkach. Przekroje pobrane ze środkowej części wyeksplantowanych wkładek, barwione hematoksyliną i eozyną (H&E). (A) Mikrofotografia przy małym powiększeniu (10x) przedstawiająca implant (oznaczony żółtą przerywaną linią) w kontekście otaczających tkanek gospodarza (tj. tkanki tłuszczowej i mięśnia szkieletowego). (B) Mikrofotografia przy dużym powiększeniu (40x) przedstawiająca liczne mikro-naczynia (żółte groty strzałek wskazują niektóre z nich) wewnątrz wkładki; mikro-naczynia można zidentyfikować jako struktury światłowate zawierające erytrocyty.

Rycina 4. Immunohistochemiczna identyfikacja ludzkich świateł naczyń. Przekroje barwione immunohistochemicznie pobrane z części środkowej eksplantowanych wtyczek. Barwienia dokonano z użyciem mysiego przeciwciała monoklonalnego przeciwko ludzkiemu CD31 (hCD31) firmy DakoCytomation (Klon JC70A; kat. # M0823) w rozcieńczeniu 1:100; jądra komórkowe dobarwiono hematoksyliną. (A) Mikrografia przy małym powiększeniu (10x) przedstawiająca implant (oznaczony czarną przerywaną linią) w kontekście otaczających go tkanek gospodarza. Specyficzne dla człowieka, CD31-dodatnie mikronaczynia są zabarwione na brązowo (barwienie peroksydazą). (B) Mikrografia przy dużym powiększeniu (40x) przedstawiająca liczne ludzkie mikronaczynia (czarna strzałka wskazuje niektóre hCD31-dodatnie światła naczyń) wewnątrz wtyczki.

Dyskusja

Jest to model eksperymentalny bioinżynierii ludzkich sieci naczyniowych. Głównymi cechami tego modelu są: 1) mikronaczynia tworzą się z ludzkich komórek wyizolowanych z tkanek postnatalnych (tj. z krwi i szpiku kostnego); 2) mikronaczynia powstają w organizmie dorosłego zwierzęcia; oraz 3) mikronaczynia nie wywodzą się z istniejących wcześniej naczyń (gospodarza), lecz powstają de novo z pojedynczych komórek zawieszonych w odpowiednim żelu.

Angiogeneza odgrywa istotną rolę w tym badaniu, ponieważ do uzyskania naczyń wypełnionych erytrocytami — co stanowi jeden z funkcjonalnych parametrów pomiarowych w tym teście — niezbędne jest połączenie z naczyniami krwionośnymi myszy. Ponadto w pierwszych dniach po transplantacji do implantu rekrutowane są mieloidalne komórki gospodarza, które są niezbędne do utworzenia nowego łoża naczyniowego ¹².

Niniejszy model eksperymentalny stanowi wszechstronny, mierzalny i stosunkowo prosty układ modelowy do badania postnatalnego tworzenia się ludzkich sieci naczyniowych in vivo. Ponadto test ten jest łatwy do przeprowadzenia i nie wymaga nacięcia ani zabiegu chirurgicznego. Model ten może być wykorzystany do badania potencjału waskulogennego różnych źródeł ludzkich komórek śródbłonka i okołonaczyniowych. Może on również służyć do przesiewowego badania związków anty- i/lub pro-waskulogennych. Wreszcie, model ten można wykorzystać do badania roli konkretnych genów w formowaniu i funkcjonowaniu sieci naczyniowej zbudowanej z ludzkiego śródbłonka.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Podłoże podstawowe dla komórek śródbłonka, EBM-2	Lonza Inc.	CC-3156
Suplementy EGM-2 SingleQuot	Lonza Inc.	CC-3162
Roztwór glutaminy, penicyliny i streptomycyny, 100x GPS	Mediatech, Inc.	30-009-CI
Zestaw do przygotowania pożywki wzrostowej dla mezenchymalnych komórek macierzystych, MSCBM/MSCGM	Lonza Inc.	PT-3001
Dulbecco z wysoką zawartością glukozy’podłoże DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium), 1x DMEM	Invitrogen	11995-073
Roztwór nieessentialnych aminokwasów MEM, 100x NEAA	Invitrogen	11140-050
pożywka Dulbecco z wysoką zawartością glukozy’proszek DMEM (środowisko DMEM)	Invitrogen	12100-046
Roztwór buforu HEPES	Invitrogen	15630-080
roztwór kolagenu bydlęcego typu I Cultrex	Trevigen Inc.	3442-050-01
Cultrex ludzka fibronektyna	Trevigen Inc.	3420-001-01
Fibrynogen z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	F8630-1G
Żelatyna	Fisher Scientific	DF0143-17-9
Dulbecco’bufor fosforanowy (PBS)	Invitrogen	14190-250
Roztwór trypsyny z EDTA, 1x	Invitrogen	25300-054
Izofluran, ciecz do inhalacji	Buxter Healthcare Corporation	NDC 10019-360-40
Trombina z osocza bydlęcego	Sigma-Aldrich	T4648-1KU
roztwór formaliny, neutralnie buforowany	Sigma-Aldrich	HT501128
Monoklonalne przeciwciało mysie anty-CD31 przeciwko antygenom ludzkim	Dako	M0823	Klon JC70A