Umieszczanie kulek powlekanych czynnikami wzrostu w zarodkach kurczat we wczesnym stadium rozwoju

Podsumowanie

Różnorodne czynniki wzrostu i białka oddziałują na siebie, indukując komórki do przyjmowania różnych przeznaczeń komórkowych podczas rozwoju. W niniejszej pracy demonstrujemy zastosowanie preparacji in ovo w celu zbadania możliwych oddziaływań między różnymi białkami w rozwoju, poprzez umieszczanie kulek w embrionach kurzych w stadium E2.5.

Streszczenie

Przewód nerwowy wykazuje ekspresję wielu białek w specyficznych wzorcach czasoprzestrzennych podczas rozwoju. Wykazano, że białka te mają krytyczne znaczenie dla determinacji losu komórek, migracji komórkowej oraz tworzenia obwodów neuronalnych. Indukcja i wzorowanie neuronalne obejmują między innymi białko morfogenetyczne kości (BMP), sonic hedgehog (SHH) oraz czynnik wzrostu fibroblastów (FGF). W szczególności wzorzec ekspresji Fgf8 występuje w bliskim sąsiedztwie regionów wykazujących ekspresję BMP4 i SHH. Wzorzec ten jest zgodny z interakcjami rozwojowymi, które ułatwiają wzorowanie w telencefalonie.

W niniejszym materiale przedstawiamy wizualną demonstrację metody, w której preparat in ovo może zostać wykorzystany do zbadania wpływu Fgfs na formowanie się przedmózgowia. Kuleczki są pokrywane białkiem i umieszczane w rozwijającej się rurce neuralnej w celu zapewnienia długotrwałej ekspozycji. Ponieważ procedura wykorzystuje małe, precyzyjnie rozmieszczone kuleczki, jest ona małoinwazyjna i pozwala na umieszczenie kilku kuleczek w obrębie jednej rurki neuralnej. Ponadto metoda ta umożliwia dalszy rozwój, dzięki czemu embriony mogą być analizowane na bardziej dojrzałym etapie w celu wykrycia zmian w anatomii i wzorowaniu neuronalnym. Ten prosty, lecz użyteczny protokół umożliwia obrazowanie w czasie rzeczywistym. Stanowi on sposób na wprowadzanie ograniczonych przestrzennie i czasowo zmian w endogennych poziomach białek.

Protokół

1. Wyjmij jaja z inkubatora

W stadium E2-2.5 (~ St. 17 HH) należy wyjąć jaja i odpowiednio je przygotować. Można przystąpić do pracy natychmiast lub zwrócić je do inkubatora na kilka godzin. Jaja można bezpiecznie przechowywać w temperaturze pokojowej przez ponad godzinę. Jaja mogą pozostać poza inkubatorem przez cały czas trwania manipulacji, które mogą czasami trwać godzinę lub dłużej.

Uwaga: Im dłużej pozostają w temperaturze pokojowej, tym mniejsza jest szansa na ich przeżycie.

2. Przygotowanie tuszu indyjskiego

1. Przygotować świeży roztwór 4% tuszu indyjskiego w sterylnym PBS.
2. Napełnić strzykawkę o pojemności 3 mL przygotowanym roztworem.
3. Na strzykawkę nałożyć igłę o rozmiarze 27 gauge i długości ½ cala.
4. Za pomocą kleszczyków hemostatycznych zgiąć igłę pod kątem 90°.

3. Otwieranie jaj i wstrzykiwanie tuszu indyjskiego

1. Za pomocą pęsety odkleić taśmę i otworzyć okno, mocując je przy pomocy drugiej strony taśmy na tylnej części jaja.
2. Wprowadzić igłę pod kątem, aż znajdzie się ona tuż pod embrionem. Umieszczenie igły pod tarczą zarodkową gwarantuje, że tusz, który jest toksyczny dla embrionu, nie wejdzie z nim w bezpośredni kontakt.
3. Należy wstrzyknąć tylko tyle tuszu, aby uzyskać odpowiedni kontrast. Zazwyczaj jest to mniej niż ¼ mL.

4. Otwieranie rurki nerwowej

1. Za pomocą precyzyjnych nożyczek chirurgicznych przetnij cienką błonę znajdującą się na powierzchni lub wokół zarodka.
2. Używając pęsety nr 55 lub sondy wolframowej, otwórz rurkę neuronalną w kierunku od tylnego do przedniego końca. Upewnij się, że otwór jest wystarczająco duży, aby można było w nim umieścić kuleczkę.

Uwaga: W zależności od wieku można użyć cienkiej sondy wolframowej w celu uzyskania tego samego efektu.

5. Odzyskiwanie powlekanych kulek heparynowo-akrylowych

1. Za pomocą pęsety 55 odnaleźć w roztworze nienaruszoną kuleczkę. Pozwolić kuleczce przywrzeć do końcówki i powoli zamknąć pęsetę.
2. Wyjąć kuleczkę z roztworu i przenieść ją nad jajo.
3. Po wyjęciu z roztworu kuleczka prawdopodobnie nie oddzieli się od pęsety, dopóki nie zostanie umieszczona w albuminie.

6. Umieszczenie kulek

1. Po umieszczeniu kuleczki na obszarze docelowym, należy za pomocą sondy wolframowej skierować ją w stronę przedmózgowia lub przymocować w tylnomózgowiu.
2. Dodaj kilka kropel PBS za pomocą pipety 10 µL.

7. Zamykanie jaja

1. Zamknij jajo, używając cienkiego kawałka taśmy, aby zatkać okienko.
2. Uszczelnij jajo zgodnie z protokołem przygotowawczym, dostępnym pod adresem https://www.jove.com/index/Details.stp?ID=306.

Dyskusja

W zależności od białka, którego chcą Państwo użyć, istnieją różne protokoły przygotowania kulek. W niniejszych eksperymentach stosujemy kulki heparynowo-akrylowe, lecz można również użyć kulek affi-gel. Stwierdziliśmy, że kulki heparynowo-akrylowe są łatwiejsze w manipulacji w środowisku wodnym albuminy jaja. Kulki namaczamy w 5 µl białka przez noc w temperaturze 4°C. Kulki kontrolne umieszcza się w sterylnym PBS aż do momentu aplikacji. Zaletą przygotowania in ovo jest fakt, że zarodek pozostaje żywy i może rozwijać się...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Jaja	Zwierzę			Zapłodnione, E2-2,5 (~ St. 17 HH)
Inkubator	Profi-I	Lyon
Tusz indyjski	Narzędzie	Higgins		Przygotować 4% roztwór w sterylnym PBS.
Sterylny PBS				Alternatywnie można zastosować koktajl przeciwciał
Strzykawka 1 ml
Igły 27G 1/2	Narzędzie	BD Biosciences	305109	Ustawione pod kątem 90 stopni
Pinceta	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.		rozmiar 55
Kleszczyki hemostatyczne
Nożyczki do sekcji	Narzędzie	World Precision Instruments, Inc.	500086	Vannas, 8,5 cm
Taśma Parafilm				do uszczelniania jaj
Sonda wolframowa	Narzędzie	Electron Microscopy Sciences	62091	Narzędzie nr 24. Uchwyt opcjonalny.