Kaniulacja ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewódna Whartonowski

Podsumowanie

Opisano protokół kaniulacji ślinianki podżuchwowej myszy poprzez przewód Whartona. W tym eksperymencie roztwór błękitu trypanowego został użyty jako barwnik, aby zademonstrować, w jaki sposób technika ta skutecznie dostarcza infuzje do docelowej ślinianki oraz aby wykazać niezawodność tego nowego podejścia jako potencjalnej klinicznej terapii lekowej lub komórkowej w regeneracji ślinianek.

Streszczenie

Ciężka niedoczynność ślinianek często występuje u pacjentów z zespołem Sjögrena oraz u osób poddawanych terapeutycznemu napromieniowaniu obszaru głowy i szyi w ramach leczenia nowotworów. Obie grupy pacjentów doświadczają takich objawów jak kserostomia (suchość w ustach), dysfagia (zaburzenia żucia i połykania), ciężka próchnica zębów, zaburzenia smaku, infekcje jam ustnej i gardła (kandydoza), zapalenie błony śluzowej, ból oraz dyskomfort.

Jedno z innowacyjnych podejść medycyny regeneracyjnej w leczeniu niedoczynności ślinianek zostało zaproponowane przez RS Redman, E Mezey et al. 2009: komórki macierzyste mogą być wprowadzane bezpośrednio do ślinianki poprzez kaniulację, co stanowi skuteczną metodę przywracania funkcji uszkodzonego narządu. Przypuszcza się, że migrujące obce komórki macierzyste zróżnicują się w komórki gruczołowe, aby funkcjonować jako część ślinianki gospodarza. Ponadto technika kaniulacji ta jest szybką i skuteczną metodą dostarczania w klinicznych zastosowaniach transferu genów.

W niniejszym materiale przedstawiamy etapy procedury kanulacji podżuchwowego gruczołu ślinowego myszy poprzez przewódna Wharton (Ryc. 1). W eksperymencie wykorzystano myszy szczepu C3H (Charles River, Montreal, QC, Kanada), utrzymywane w standardowych warunkach czystości w centrum zasobów zwierzęcych Uniwersytetu McGill. Wszystkie eksperymenty zostały zatwierdzone przez Uniwersytecki Komitet ds. Opieki nad Zwierzętami i przeprowadzono zgodnie z wytycznymi Kanadyjskiej Rady ds. Opieki nad Zwierzętami.

W tym doświadczeniu roztwór błękitu trypanu jest wprowadzany do gruczołu przez ujście przewodu Whartona za pomocą strzykawki insulinowej z igłą 29G umieszczoną wewnątrz rurki polietylenowej. Następnie mysz jest sekowana, aby wykazać, że infuzje skutecznie przedostały się do gruczołu.

Protokół

1. Opis procedury

1. Wstrzyknij podskórnie każdemu myszy 1 μl / g masy ciała 0,5 mg / ml siarczanu atropiny monohydratu (Kat# 11330, Fluka, USA), aby zapobiec wydzielaniu śliny, która mogłaby zakłócić wprowadzanie infuzji.
2. Zanestezuj każdą mysz, wstrzykując domięśniowo (I.P.) 1 μl / g masy ciała roztworu zawierającego 100 mg / ml ketaminy i 20 mg / ml ksylazyny (Phoenix Scientific, AR, USA).
3. Umieść mysz w pozycji brzusznej na specjalnie wykonanej plastikowej platformie: siekacze szczękowe zostają zablokowane na metalowym drucie, a siekacze żuchwowe zaczepione o elastyczną sznurówkę w celu utrzymania otwartej jamy ustnej.
4. Użyj strzykawki insulinowej z igłą 29G (Kat# 600145, Tyco Healthcare, MA, USA) umieszczonej wewnątrz rurki polietylenowej o średnicy 0,58 mm (Kat# 427410, Becton Dickinson, MD, USA; Rys. 2). Rurka polietylenowa jest nasunięta na 5 mm końcówkę igły 29G. Igła służy jako sztywny prowadnik do wprowadzenia rurki polietylenowej do przewodu Whartona. Rurkę polietylenową wprowadza się na 3-5 mm do wnętrza przewodu. Należy pamiętać, że do przewodu ślinowego wnika tylko rurka polietylenowa, podczas gdy igła pozostaje poza przewodem. Wstrzyknij 50ul przefiltrowanego 0,4% roztworu barwiącego błękitu trypanu (Kat# 15250, Gibco, USA) do gruczołu podżuchwowego przez przewód Whartona, znajdujący się bezpośrednio pod językiem. Infuzję podaje się jednostajnie, wywierając dodatni nacisk na tłok strzykawki; palec pozostaje na tłoku nawet po podaniu całej infuzji do gruczołu, aby zapobiec cofaniu się roztworu do jamy ustnej. Roztwór błękitu trypanu został użyty w materiale wideo jako barwnik w celu zademonstrowania techniki.
5. Po wstrzyknięciu roztworu błękitu trypanu mysz została poddana eutanazji przed sekcją. Gruczoł ślinowy zostaje chirurgicznie odsłonięty, aby określić, jaka ilość infuzji faktycznie pozostała w gruczole.

2. Reprezentatywne wyniki:

Po wstrzyknięciu infuzji dokonano sekcji myszy, aby chirurgicznie odsłonić kaniulowaną śliniankę. Jak pokazano na Obrazie-2, ciemne zabarwienie przewoduna Whartona świadczy o prawidłowym przeprowadzeniu infuzji roztworu błękitu trypanu.

Rycina 1. Kanulacja gruczołu podżuchwowego myszy.

Rysunek 2. Rurka polietylenowa jest nasunięta na końcówkę igły o rozmiarze 29G. Igła strzykawki służy jako sztywny prowadnik do wprowadzenia rurki polietylenowej do przewodu Whartona. Rurka polietylenowa jest wprowadzana (kaniulowana) na głębokość 3-5 mm do wnętrza przewodu. Należy zwrócić uwagę, że do przewodu ślinowego wprowadzana jest wyłącznie rurka polietylenowa, podczas gdy igła pozostaje poza przewodem.

Dyskusja

Trudnością przy stosowaniu tej metody kanulacji jest zapobieganie cofaniu się wstrzykniętego roztworu. Nawet jeśli roztwór błękitu trypanowego pomyślnie przeniknął tymczasowo do ślinianki, wydzielanie śliny może zakłócić infuzje i spowodować cofnięcie się roztworu błękitu trypanowego z gruczołu. W ramach środków ostrożności, oprócz zastosowania atropiny w celu zahamowania wydzielania śliny, kaniula polietylenowa powinna pozostać w przewodzie Wharton'a, a tłok strzykawki należy trzymać przez 60 sekund po podaniu infuzji. ...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Atropina	Lek	Fluka	11330	Do hamowania wydzielania śliny
Ketamina	Lek	Phoenix Scientific		Sedacja
Ksylazyna	Lek	Phoenix Scientific
Rurka polietylenowa (średnica 0,58 mm)	Rurka	Intramedic	427410	Do nałożenia na końcówkę igły w celu uniknięcia uszkodzenia tkanek podczas wprowadzania do przewodu Whartona’s.
Strzykawka insulinowa Ultra Comfort (z igłą 29G)	Strzykawka	Tyco Healthcare, Covidien	600145
4% błękit trypanowy	Barwnik	GIBCO, by Life Technologies	15250