Test angiogenezy w krezoni szczura

Podsumowanie

Normalna unaczyniona tkanka ssaka dorosłego, w której nie zachodzi fizjologiczna angiogeneza i która nie była poddana interwencji chirurgicznej, jest wykorzystywana do badania: (i) inicjacji i rozwoju angiogenezy po podaniu środków testowych do jamy otrzewnej; oraz (ii) modyfikacji angiogenezy po systemowym podaniu wybranych środków testowych.

Streszczenie

Test angiogenezy w oknie krezkowym dorosłego szczura jest biologicznie odpowiedni i wyjątkowo dobrze nadaje się do badania angiogenezy kiełkującej in vivo [patrz prace przeglądowe], która jest dominującą formą angiogenezy w ludzkich nowotworach i tkankach pozanowotworowych, jak omówiono w zaproszonych pracach przeglądowych^1,2. Angiogenezę indukowaną w błonistych częściach krezki poprzez podanie dootrzewnowe (i.p.) czynnika proangiogennego można modulować za pomocą podania podskórnego (s.c.), dożylnego (i.v.) lub doustnego (p.o.) wybranych czynników modyfikujących. Każda błonista część krezki jest półprzezroczysta i obramowana tkanką tłuszczową, co nadaje jej wygląd przypominający okno.

Test ten posiada następujące zalety: (i) badana tkanka jest naturalnie unaczyniona, choć w niewielkim stopniu, a ze względu na to, że jest niezwykle cienka, sieć mikronaczyniowa jest praktycznie dwuwymiarowa, co pozwala na mikroskopową ocenę całej sieci in situ; (ii) u dorosłych szczurów badana tkanka nie wykazuje znaczącej fizjologicznej angiogenezy, która charakteryzuje większość normalnych tkanek dorosłych ssaków; stopień naturalnego unaczynienia jest jednak skorelowany z wiekiem, co omówiono w¹; (iii) pomijalny poziom angiogenezy indukowanej urazem zapewnia wysoką czułość; (iv) test odzwierciedla sytuację kliniczną, ponieważ badane leki modulujące angiogenezę są podawane systemowo, a obserwowane odpowiedzi odzwierciedlają efekt netto wszystkich zmian metabolicznych, komórkowych i molekularnych wywołanych leczeniem; (v) test umożliwia obiektywną, ilościową i bezstronną ocenę zmiennych dotyczących przestrzennego zasięgu mikronaczyniowego, gęstości i formowania wzorca sieci, a także kiełkowania naczyń włosowatych, co pozwala na rzetelną analizę statystyczną zależności dawka-efekt oraz struktura molekularna-aktywność; oraz (vi) test z wysoką czułością ujawnia toksyczne lub szkodliwe efekty leczenia w postaci obniżonego tempa fizjologicznego przyrostu masy ciała, ponieważ dorosłe szczury rozwijają się dynamicznie.

Angiogeneza indukowana przez komórki tuczne została po raz pierwszy wykazana przy użyciu tego testu^3,4. Model ten wykazuje wysoki stopień rozróżnienia w odniesieniu do zależności dawka-efekt oraz mierzalnych efektów systemicznie podawanych leków i białek blisko spokrewnionych chemicznie lub funkcjonalnie, w tym: (i) standardowych chemioterapeutyków podawanych metronomicznie w niskich dawkach, które wywołują zróżnicowane, specyficzne dla danego leku efekty (t.j. działanie hamujące angiogenezę, neutralne lub stymulujące angiogenezę⁵); (ii) naturalnej, nienasyconej żelazem ludzkiej laktoferyny, która stymuluje angiogenezę zależną od VEGF-A⁶, oraz naturalnej, nienasyconej żelazem bydlęcej laktoferyny, która hamuje angiogenezę zależną od VEGF-A⁷; oraz (iii) frakcji heparyny o niskiej masie cząsteczkowej otrzymywanych różnymi metodami^8,9. Ponadto test ten jest wysoce odpowiedni do badań nad skumulowanym efektem na angiogenezę substancji podawanych systemicznie w sposób jednoczesny lub sekwencyjny.

Pomysł stworzenia tego filmu pojawił się u zmarłego dr. Judaha Folkmana, gdy odwiedził nasze laboratorium i zapoznał się z prezentowaną metodologią.

Artykuły przeglądowe (zaproszone), omawiające i oceniające analizę

Norrby, K. In vivo modele angiogenezy. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).

Norrby, K. Badania nad lekami z wykorzystaniem modeli angiogenezy. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Protokół

1. Zwierzęta

1. Jako modele zwierzęce wykorzystywano małe gryzonie, takie jak szczury, myszy i świnki morskie. Niestety, u dorosłych myszy (oceniano wiele szczepów) często brakuje lub występuje bardzo mała liczba potencjalnych naczyń macierzystych (z których może rozpocząć się angiogeneza) w obrębie okna krezkowego, co sprawia, że badania z wykorzystaniem myszy są niewiarygodne. Dlatego test ten opracowano przede wszystkim dla szczurów.
2. Szczury, które po dostarczeniu od hodowcy są aklimatyzowane w standardowym środowisku przez co najmniej 7 dni, zazwyczaj przebywają w parach w standardowych klatkach w 12-godzinnym cyklu światła/ciemności z wolnym dostępem do wody i paszy granulowanej. Każde zwierzę jest oznakowane. Stosujemy głównie młode dorosłe szczury (zazwyczaj w wieku 7–10 tygodni, różnych szczepów, ale najczęściej samce szczurów Sprague-Dawley; u szczurów młodszych niż 5–6 tygodni liczba naturalnych mikronaczyń ma tendencję do bycia niską) pozyskane od różnych hodowców. W okresie poprzedzającym eksperyment oraz w jego trakcie zwierzęta są ważone co drugi dzień, a zawsze również w dniu utylizacji. W przypadku jednoczesnego podawania preparatów i.p. (w celu indukcji angiogenezy, patrz niżej) oraz s.c., i.v. lub p.o., zwierzęta są ważone codziennie. Umożliwia to utworzenie grup eksperymentalnych i kontrolnych o równej masie ciała na początku eksperymentu oraz pozwala na monitorowanie wpływu leczenia na przyrost masy ciała w trakcie trwania badania. Ponieważ dorosłe samce szczurów rozwijają się fizjologicznie w sposób dynamiczny (przybierając około 40–60 g na tydzień w zależności od szczepu), zahamowanie przyrostu masy ciała jest czułym markerem zastępczym toksyczności, ogólnego stanu zdrowia, anoreksji oraz zahamowania wzrostu.

Pracujemy w wysokostandardowym ośrodku opieki nad zwierzętami i dokładamy wszelkich starań, aby zminimalizować poziom stresu doświadczanego przez zwierzęta. Obowiązujące wytyczne etyczne są zgodne z zasadami opracowanymi przez Workman P. et al. (Guidelines for the welfare and use of animals in cancer research. Br. J. Cancer 102, 1555-77, 2010). Badania te zostały zatwierdzone przez Komisję Etyki ds. Zwierząt Uniwersytetu w Göteborgurgu.

2. Proangiogenne leczenie doprzewnowe

1. Kandydat na czynnik proangiogenny do przetestowania zostaje rozpuszczony i rozcieńczony w soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn, stosowanej do infuzji u pacjentów (nawet w skrajnie niskich stężeniach endotoksyna wykazuje działanie proangiogenne). Wszystkie roztwory są przygotowywane na świeżo w dniu wstrzykiwania, filtrowane sterylnie (filtr Millipore 0,22-μm), sprawdzane pod kątem neutralnego pH (7,1-7,3) i podawane w temperaturze pokojowej.
   Substancja testowa jest wstrzykiwana w niskich lub bardzo niskich stężeniach. Na przykład szczurzy rVEGF₁₆₄ (564-RV/CF; R&D Systems Europe, Ltd., Oxon, UK), który jest dominującą izoformą VEGF-A u szczurów, jest rozcieńczany do 96 pmole/ml w soli fizjologicznej wolnej od endotoksyn, zamrażany, a następnie rozmrażany, po czym objętość 5 ml jest wstrzykiwana i.p. szczurowi. Do wstrzykiwań i.p. używamy strzykawki 5-ml z igłą 0,8-mm (igła zielona, 21G). Taka terapia, stosowana dwa razy dziennie przez 4,5 dnia, t.j. od poniedziałku rano (Dzień 0) do piątku rano (Dzień 4), indukuje silną odpowiedź angiogenezy kiełkującej w testowanej tkance krezowej, osiągającą szczyt około 21. dnia.
   Podawanie roztworu i.p. zapewnia dostarczenie całej objętości do jamy otrzewnej (a nie do jelit, pęcherza czy jakiegokolwiek innego narządu). Szybkie wstrzyknięcie 5 ml pozwala operatorowi taktylnie potwierdzić, że strumień cieczy przeszedł przez ścianę brzuszną do jamy brzusznej.
   Następnie, przed lub równocześnie z proangiogenną terapią i.p., można systemicznie podać dowolną wybraną substancję testową.

3. Systemiczne podawanie czynników modulujących angiogenezę

1. Można zastosować każdą inną drogę podania niż droga dosytnynowa (i.p.), ponieważ leczenie i.p. może wpływać na przebieg reakcji angiogennej poprzez indukcję stanu zapalnego lub potencjalną aktywację komórek tucznych w badanej tkance, co może prowadzić do silnej odpowiedzi proangiogennej. Oprócz podawania doustnego lub pojedynczego wstrzyknięcia podskórnie (s.c.) lub dożylnie (i.v.), często stosujemy podawanie s.c. za pomocą osmotycznych minipomp (jednej lub większej liczby pomp, o różnych objętościach i czasach pompowania), aby dostarczać roztwór ze stałą prędkością przez okres do dwóch lub kilku tygodni.
2. Ciągła infuzja podskórna substancji badanych
   Napełnianie i implantacja osmotycznych minipomp
   Zazwyczaj w 5. dniu, t.j. jeden dzień po zakończeniu leczenia i.p. VEGF, osmotyczne minipompy (na przykład model 2ML2, o stałej prędkości pompowania 5,0 μl/h przez 14-15 dni; Alzet Osmotic Pumps, Mountain View, CA, USA) są napełniane w warunkach sterylnych substancją badaną lub odpowiednim nośnikiem. Po przechowywaniu w sterylnym 0,9% (w/v) NaCl przez noc w temperaturze 37°C, pompę(pompy) implantuje się chirurgicznie s.c. na grzbietach (przy kręgosłupie w okolicy łopatek) szczurów znieczulonych izofluranem (Isoba vet; Schering-Plough Animal Health, Merck & Co., Inc., Whitehouse Station, NJ, USA), początkowo w szczelnej przezroczystej komorze, a następnie za pomocą maski (aby zminimalizować stres u kolejnego zwierzęcia, komorę przepłukuje się powietrzem przed ponownym użyciem). Cięcie skóry wykonane w celu implantacji pompy zostaje zaszyte nicią jedwabną natychmiast po implantacji.
   Ponieważ zwierzęta fizjologicznie przybierają na wadze w okresie eksperymentalnym, a substancje badane są podawane ze stałą prędkością, faktyczna dawka leku badanego wybrana na kg masy ciała jest wyższa niż średnia dawka na początku okresu infuzji i niższa niż średnia dawka na koniec okresu infuzji.
   Ciągła infuzja, opisana w niniejszym protokole, może być postrzegana jako rozszerzona forma leczenia metronomicznego.

4. Zakończenie eksperymentu

1. Jedno zwierzę na raz umieszcza się w przezroczystej szczelnej komorze, którą przepłukuje się gazem CO₂, co prowadzi do szybkiej śmierci zwierzęcia. Przed ponownym użyciem komorę przepłukuje się powietrzem.

5. Pobieranie próbek tkanki

1. Zgodnie z materiałem na DVD, należy otworzyć ścianę brzuszną i zidentyfikować krezkę jelita cienkiego, w tym jej najbardziej dystalną część sięgającą zastawki krzyliczo-kątniczej (miejsca połączenia jelita cienkiego z jelitem grubym). Cztery (lub więcej) najbardziej dystalnie położonych „okien” krezki należy ponumerować i rozprowadzić na standardowych, nieobrobionych szkiełkach obiektowych Superfrost Plus (DAKO Denmark A/S, Glostrup, Dania). Należy w miarę możliwości unikać zanieczyszczenia próbek krwią, treścią jelitową lub innymi płynami ustrojowymi, ponieważ materiały te mogą ulec nieswoistemu barwieniu, choć nie unieważnia to późniejszej wizualizacji immunohistochemicznej mikro naczyń.
2. Każdy preparat okna krezki z przytwierdzonym segmentem jelita cienkiego należy rozprowadzić na szkiełku i suszyć w temperaturze pokojowej przez 20 minut. Następnie odcina się kikut jelita, a nienaruszone preparaty błoniaste krezki przechowuje w temperaturze -20°C przez dłuższy czas. Jest to pokazane na DVD.

Należy wspomnieć, że tkankę oraz drożne naczynia krwionośne można zwizualizować przed pobraniem za pomocą intravitalnej mikroskopii w świetle przechodzącym.

6. Protokół barwienia immunohistochemicznego mikronaczyń

1. Dzień 0
   Próbki rozmraża się z -20°C do temperatury pokojowej, suszy w szafce w temperaturze 60°C przez 1 h, a następnie pozostawia w temperaturze pokojowej na noc.
2. Dzień 1
   PrzeszkCia umieszcza się w uchwytach do barwienia (w co drugim rowku) w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.8) przez 10 minut w temperaturze pokojowej. Roztwór jest odrzucany i zastępowany kolejnym roztworem, analogicznie w każdym z następujących kroków.
3. Obróbka trypsyną
   Naczynie do barwienia, w którym znajduje się uchwyt do szkiełek, napełnia się roztworem trypsyny (25°C przez 20 minut). Roztwór odrzuca się i dwukrotnie inkubuje w 2,5% roztworze sacharozy (temperatura pokojowa po 10 minut za każdym razem). Roztwór odrzuca się i kilka razy płucze w aqua dest (temperatura pokojowa przez kilka minut za każdym razem).
4. Blokowanie
   Naczynie do barwienia, w którym znajduje się uchwyt do szkiełek, napełnia się 0,5% H₂O₂ w metanolu (temperatura pokojowa przez 30 minut). Roztwór odrzuca się i płucze w aqua dest (temperatura pokojowa przez kilka minut). Roztwór odrzuca się i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.4) (temperatura pokojowa po 8 minut za każdym razem).
5. Inkubacja
   Wszystkie inkubacje przeprowadzane są w komorze nawilżanej w temperaturze pokojowej. Na każde szkiełko nanosi się około 150 μl każdego z wymienionych poniżej roztworów. Szkiełka umieszcza się w komorze nawilżanej, a roztwory nanosi pipetą na próbki (części niebłoniaste nie muszą być pokryte roztworami).
   Przed dodaniem kolejnego roztworu, w każdym z poniższych kroków, należy ostrożnie wstrząsnąć szkiełko, aby usunąć cały poprzedni roztwór.
   1. Inkubacja z normalnym serum blokującym (końskie) (zestaw ABC) 3 krople żółtego roztworu/10 ml buforu do rozcieńczania przez 20 minut.
   2. Inkubacja z przeciwciałem pierwszorzędowym ARU0181, które znakuje naczyniowe komórki śródbłonka szczura. Przeciwciało rozcieńcza się 1:600 w buforze do rozcieńczania (Biosource) (100 μl rozcieńczone 40-krotnie [zamrożone] plus 900 μl buforu do rozcieńczania); inkubacja odbywa się przez noc w 4°C.
6. Dzień 2
   Szkiełka wyjmuje się z komory nawilżanej, usuwa przeciwciało pierwszorzędowe, a następnie umieszcza szkiełka w uchwycie do barwienia, który zanurza się w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.8) przez 8 minut.
   1. Inkubacja z przeciwciałem biotynylowanym (zestaw ABC)
      Szkiełka układa się poziomo w komorze nawilżanej i inkubuje z 1 kroplą niebieskiego roztworu/10 ml buforu do rozcieńczania przez 30 minut. Roztwór odrzuca się, a szkiełka umieszcza w uchwycie w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.4) przez 8 minut.
   2. Inkubacja z odczynnikiem ABC
      Szkiełka ponownie układa się poziomo w komorze nawilżanej i nanosi pipetą na części błoniaste próbek następujące roztwory: 2 krople pomarańczowego roztworu plus 2 krople brązowego roztworu/10 ml TBS (pH 7.4) przez 30 minut. Wymieszać dokładnie 30 minut przed użyciem! Roztwór odrzuca się, a szkiełka umieszcza w uchwycie w naczyniu do barwienia i płucze dwukrotnie w TBS (pH 7.4) przez 8 minut.
7. Barwienie DAB (0,05%)
   Ten etap musi być wykonany w wentylowanej komorze chemicznej!
   Szkiełka przygotowuje się i nanosi pipetą roztwór 3,3-diaminobenzydyny (DAB; Sigma-Aldrich): 0,1% roztwór DAB w TBS (pH 7.4) [zamrożony] rozcieńcza się 1:1 z mieszaniną 10 μl H₂O₂ i 7,5 ml TBS (pH 7.4). Roztwór ten filtruje się sterylnie bezpośrednio przed użyciem (aby usunąć wszelkie cząsteczki, które mogłyby zaburzyć obraz mikroskopowy). Próbki barwi się przez 8 minut. Roztwór odrzuca się, a szkiełka umieszcza w uchwycie w naczyniu do barwienia. Płucze się pod bieżącą wodą z kranu, a następnie w aqua dest przez kilka minut.
8. Odwodnienie
   Szkiełka pozostają w uchwycie do barwienia. Płukanie odbywa się poprzez odlewanie i ponowne napełnianie naczynia do barwienia zawierającego aqua dest/etanol: aqua dest, 70% alkohol, 95% alkohol, alkohol absolutny, po 2 minuty w każdym roztworze.

7. Obrazowanie i ocena sieci mikro naczyniowej w każdym preparacie okna krezowego po barwieniu immunohistochemicznym komórek śródbłonka naczyniowego

Jak pokazano w filmie, mikronaczynia są wizualizowane mikroskopowo in situ w nienaruszonym tkance.

1. Najpierw, używając mikroskopu rysunkowego z zakresem powiększenia od 14 do 34 (Leica Wild M 3Z), odrysowujemy ołówkiem na białej kartce cały obszar okna, a także cały obszar unaczyniony (VA) w obrębie okna krezowego. VA, jako procent całego obszaru, można łatwo zmierzyć za pomocą planimetrii komputerowej lub niekomputerowej (lub po prostu poprzez wycięcie i zważenie obrazu całego okna oraz obrazów wszystkich jego unaczynionych części).
2. Używając innego mikroskopu rysunkowego, poszczególne profile mikronaczyni, które są łatwo identyfikowalne, rysuje się czarnym tuszem na białej kartce przy powiększeniu 80 w losowo wybranych polach. Jest to punkt wyjścia do późniejszej komputerowej oceny morfometrycznej długości mikronaczyni (MVL), która w zasadzie jest pomiarem gęstości mikronaczyni.
3. Opcjonalnie można wyznaczyć zmienne związane z formowaniem wzorca mikronaczyni oraz zmienne służące do oceny liczby pączków mikronaczyniowych oraz długości poszczególnych pączków mikronaczyniowych (odpowiednio No. SP i Le. SP). Optymalny kontrast między przedstawionymi czarnymi strukturami naczyń a białym tłem ułatwia szczegółową analizę obrazów w większości komercyjnych komputerowych programów morfometrycznych.
4. W większości przypadków głównymi zmiennymi są VA i MVL, których iloczyn daje całkowitą długość mikronaczyni (TMVL).

8. Analiza statystyczna

Zazwyczaj do analizy obserwacji nieparowanych (obustronnych) stosujemy standardowy nieparametryczny test U Mann-Whitney'a. Jako niezależny punkt danych dla każdej zmiennej okna krezkowego przyjmuje się średnią z czterech okien krezkowych na zwierzę. Kryterium istotności statystycznej wynosi P ≤ 0,05.

Dyskusja

Test wprowadzono w 1986 roku³, a następnie sukcesywnie rozwijano i udoskonalano w naszym laboratorium^7,10-12. Jak omówiono w artykułach przeglądowych (zaproszonych)^{1, 2}, metoda ta wypada korzystnie w porównaniu z innymi testami angiogenezy in vivo u ssaków, szczególnie w odniesieniu do kluczowych cech, takich jak: zastosowanie tkanki testowej u osobników dorosłych, która jest naturalnie unaczyniona i nie wykazuje fizjologicznej angiogenezy; minimalny stopień urazu tkanki (jeśli taki występuje); pomiar rzeczywistych zmiennych ilościowych, co umożliwia rzetelną analizę statystyczną w badaniach zależności dawka-odpowiedź oraz aktywności molekularnej; występowanie angiogenezy pączkującej, która dominuje w tkankach prawidłowych i nowotworach; oraz łatwość gromadzenia danych o toksyczności u szczurów, które wykazują prawidłowy, silny wzrost w wieku dorosłym. Do wad metody może należeć fakt, że test jest stosunkowo czasochłonny, zwłaszcza przy ocenie liczby i długości poszczególnych segmentów mikronaczyń oraz pączków mikronaczyniowych; brak możliwości obserwacji w czasie rzeczywistym lub obserwacji seryjnych; a także niska przydatność w przypadku myszy, ponieważ wiele okien krezkowych u myszy nie posiada potencjalnych naczynia macierzystego, z którego mogłyby powstać nowe kapilary.

Obserwacje w czasie rzeczywistym są jednak możliwe dzięki mikroskopii intravitalnej, w której eksternalizowane, ale nienaruszone okna krezkowe są rozłożone na stole mikroskopu podczas znieczulenia zwierzęcia, jak omówiono w¹.

W ciągu ostatnich dziesięcioleci, dzięki zastosowaniu takich modeli jak mikrokieszonki rogówkowe, błona sieciowato-owocznia kurczaka oraz testy z zatyczkami z Matrigelu podskórnie, osiągnięto znaczące postępy w badaniach nad angiogenezą; są to narzędzia użyteczne, lecz w ostateczności ograniczone. Przyszłe zastosowania kliniczne terapii antyangiogennych i proangiogennych wymagają opracowania i walidacji bardziej czułych, biologicznie istotnych i w pełni ilościowych modeli przedklinicznych, takich jak model opisany w niniejszym raporcie.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
i odczynniki
0,5 M roztwór podstawowy Tris-HCl (pH 7,8) Tris (hydroksymetylo) aminometan (60,57 g) rozpuszcza się w ~900 ml aqua dest i dodaje ~45 ml 25% HCl (stężonego) w celu uzyskania pH 7,8, a następnie rozcieńcza do 1 litra aqua dest.
Tris-buffer sola fizjologiczna (TBS; pH 7,8) Do 200 ml roztworu podstawowego dodaje się 18 g NaCl rozpuszczonego w ~1800 ml aqua dest z dostosowaniem pH do 7,8 za pomocą roztworu podstawowego, a następnie rozcieńczeniem do 2 litrów za pomocą aqua dest.
TBS (pH 7,4) Do 200 ml roztworu podstawowego dodaje się 18 g NaCl rozpuszczonego w rozpuszczonym w ~1800 ml aqua dest z dostosowaniem pH do 7,4 za pomocą roztworu podstawowego, a następnie rozcieńczeniem do 2 litrów za pomocą aqua dest.
Roztwór trypsyny (0,05% trypsyny, 0,1% CaCl2) Zawiera 0,1 g trypsyny i 0,2 g CaCl2 w 200 ml TBS (pH 7,8).
Roztwór sacharozy 2,5% Zawiera 5 g sacharozy w 200 ml TBS (pH 7,8).
Podstawowy roztwór 1% azydku sodu w TBS (pH 7,4) Zawiera 1 g Na-azydku w 100 ml z TBS (pH 7,4).
Bufor rozcieńczający: 0,1% BSA, 0,01% Na-azydek (Służy do rozcieńczania przeciwciał w zestawie Vectatain ABC). Zawiera 0,1 g albuminy surowicy bydlęcej (BSA) i 1 ml 1% Na-azydku, rozcieńczonego do 100 ml z TBS (pH 7,4).
ABC kit Vectastain PK 4002, mysia peroksydaza ABC IgG normalna surowica końska; surowica blokująca; żółty roztwór: 3 krople/10 ml buforu rozcieńczającego. Przeciwciało biotynylowane; przeciwciało anty-mysie; niebieski roztwór: 1 kropla/10 ml buforu do rozcieńczenia. odczynnik ABC: roztwór pomarańczy, 2 krople plus brązowy roztwór 2 krople/10 ml TBS (pH 7,4).
Mieszaj te roztwory 20 minut przed użyciu!
Myszy (monoklonalny) antyszczurzy śródbłonek(Biosource International, Camarillo, CA, USA)
To przeciwciało jest skierowane przeciwko wszystkim komórkom śródbłonka naczyń krwionośnych u szczura, z wyjątkiem tych w mózgu.
zestaw do zestawu Avidin Biotin Complex (ABC) peroksydazy wektastainowej Zestaw zawiera przeciwciało pierwszorzędowe, przeciwciało drugorzędowe biotynylowane, kompleks enzymatyczny awidyny-biotynylowany (ABC) i substrat enzymu. Zobacz www.vectorlabs.com lub www.immunkemi.se dla protokołów.
Albumina surowicy bydlęcej(BSA) (Sigma-Aldrich, katalog # A-4503). DAB= 3,3'-Diaminobenzydyna Isopac (Sigma-Aldrich, katalog # D 9015). Trypsynaz trzustki bydlęcej (Sigma-Aldrich, katalog # T 4665). Peroksydaza wektastainowa ABC-kit, Mysie IgG (Immunkemi F & D AB, Jarfalla, Szwecja)