Immunohistochemia: skrawki w parafiniie z użyciem zestawu Vectastain ABC firmy Vector Labs

Streszczenie

Immunohistochemia (IHC) jest cenną techniką wykorzystywaną do lokalizacji i wizualizacji ekspresji białek w preparacie tkankowym przy użyciu swoistych przeciwciał. Istnieją dwie metody: bezpośrednia i pośrednia. W niniejszym doświadczeniu opiszemy wyłącznie zastosowanie pośredniego barwienia IHC. Pośrednie barwienie IHC wykorzystuje wysokoswoiste przeciwciała pierwszorzędowe oraz przeciwciała drugorzędowe sprzężone z biotyną. Przeciwciała pierwszorzędowe służą do precyzyjnej identyfikacji białek docelowych poprzez wiązanie się ze swoistym epitopem, natomiast przeciwciała drugorzędowe ograniczają nieswoiste barwienie tła i wzmacniają sygnał poprzez tworzenie kompleksów z przeciwciałami pierwszorzędowymi. Preparaty mogą być przygotowane z cięć mrożonych lub cięć zatopionych w parafinie, naniesionych na szkiełka przedmiotowe. W niniejszym protokole omawiamy przygotowanie cięć zatopionych w parafinie poprzez odparafinowanie, nawadnianie z użyciem gradientu alkoholi, termiczną regenerację antygenów oraz blokowanie endogennej aktywności peroksydazy i nieswoistych miejsc wiązania. Część preparatów barwi się przeciwciałami swoistymi dla markera limfocytów T CD8, natomiast pozostałe barwi się pod kątem hydroksylazy tyrozynowej. Następnie szkiełka poddaje się działaniu odpowiednich przeciwciał drugorzędowych sprzężonych z biotyną, a następnie wywołuje przy użyciu peroksydazy chrzanowej (HRP) sprzężonej z awidyną, stosując diaminobenzydynę (DAB) jako substrat. Po wywołaniu preparaty poddaje się barwieniu kontrastowemu, a następnie zamyka pod szkiełkami nakrywkowymi za pomocą medium Permount. Po odpowiednim wyschnięciu szkiełka są gotowe do obrazowania.

Protokół

Barwienie skrawków parafinaowych

1. Odparafinizować preparaty za pomocą ksylenu (Fisher X3^S-4), powtarzając czynność 3 razy po 5 minut (wymieniać ksylen co miesiąc w zależności od zużycia; ksylen jest TOKSYCZNY). Należy używać naczyń i pokrywek na 20 preparatów marki Fisher ref 08-812-1A oraz statywów dopasowanych do tych naczyń. 200 ml cieczy na naczynie.
2. Rehydratować poprzez gradient alkoholi w następujący sposób (wymieniać gradient co 2 tygodnie):
   • 2x w 100% etanolu (Fisher # A406-20) po 2 min each
   • 2x w 95% etanolu po 2 min each
   • 1x w 70% etanolu przez 2 min
   • 1x w 50% etanolu przez 2 min
   • 1x w 30% etanolu przez 2 min
   • 1x w ddH₂O przez 2 min
3. Moczyć w DPBS przez 5 min (DPBS = zmodyfikowany przez Dulbecco roztwór soli fosforanowej z dodatkiem Ca²⁺ i Mg²⁺).

Odzyskiwanie antygenu:

1. Podgrzać bufor cytrynianowo-sodowy (10 mM, pH 6,5) w mikrofalówce.
2. Gotować preparaty na szkiełkach przez 15 min w mikrofalówce. Szkiełka nie mogą wyschnąć, dlatego należy sprawdzać je co minutę i w razie potrzeby dolewać bufor cytrynianowo-sodowy.
3. Pozostawić do ostygnięcia w temperaturze pokojowej.
4. Zablokować endogenną aktywność peroksydazy za pomocą 1% H₂O₂ w DPBS przez 20 min (1,5 ml 30% roztworu zapasowego Sigma H-1009 w 50 ml DPBS).
5. Przemyć w DPBS 3 x 5 min.
6. Zablokować miejsca niespecyficzne, inkubując preparaty przez noc w temperaturze +4°C w DPBS + 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,1% azotku sodu + 5% surowicy.
   
   Uwaga: Wybór surowicy zależy od gatunku, w którym otrzymano przeciwciała użyte do barwienia. Należy blokować surowicą z gatunku, w którym otrzymano przeciwciało wtórne (sprzężone z biotyną). Jeśli nie jest ona dostępna, należy użyć surowicy z gatunku innego niż ten, w którym otrzymano przeciwciało pierwotne.
   
   
7. Zablokować miejsca wiązania biotyny za pomocą zestawu blokującego awidyna/biotyna (Vector Laboratories, katalog nr SP-2001):
   • Inkubować z awidyną D przez 15 min. Krótko przepłukać w DPBS.
   • Inkubować z roztworem biotyny przez 15 min.
8. Inkubować z przeciwciałem pierwotnym przez 2 h w temperaturze pokojowej w DPBS + 2% BSA + 0,1% azotku sodu + 2% surowicy (tak samo jak w kroku blokowania).
9. Przemyć w PBS 3 x 5 min.
10. Inkubować z przeciwciałem wtórnym sprzężonym z biotyną przez 1 h w temperaturze pokojowej w DPBS + 2% BSA + 0,1% azotku sodu + 2% surowicy (tak samo jak w kroku blokowania).
11. Przygotować odczynnik ABC w tym samym czasie, ponieważ musi on dojrzewać przez co najmniej 30 min przed użyciem!!! (patrz Materiały)
12. Przygotować w probówce stożkowej 50 ml. Do 15 ml DPBS (bez surowicy, bez azotku) dodać 3 krople odczynnika A, wymieszać, dodać 3 krople odczynnika B i wymieszać. Unikać ściskania butelek; lepiej poczekać, aż krople utworzą się samodzielnie. Zestaw ABC Vectastain PK-6100 z Vector Labs.
13. Przemyć w DPBS 3 x 5 min.
14. Inkubować z odczynnikiem ABC przez 30-45 min w temperaturze pokojowej.
15. Przemyć w DPBS 3 x 5 min.
16. Przygotować podłoże peroksydazy DAB (Vector Labs # SK-4100) w 5 ml ddH₂O w szklanej fiolce bezpośrednio przed użyciem (patrz Materiały):
    • 2 krople roztworu zapasowego buforu, wymieszać
    • 4 krople DAB, wymieszać (roztwór powinien stać się lekko brązowy)
    • 2 krople H₂O₂, wymieszać
17. Nanieść podłoże DAB na szkiełka i obserwować pojawienie się brązowego zabarwienia.
18. Zanurzyć szkiełka w wodzie z lodem z kranu, aby zatrzymać reakcję.
19. Płukać pod zimną bieżącą wodą przez 5 min.
20. Przebarwić hematoksyliną (20 s; Fisher CS401-D) i płukać w wodzie z kranu, aż woda będzie przejrzysta.
21. Odwodnić w gradiencie alkoholowym, zaczynając od 30% etanolu do 100% etanolu (po 2 min na każdym stopniu).
22. Moczyć w ksylenie 3 x 5 min.
23. Zamontować za pomocą Permount (Fisher # SP15-100): nanieść niewielką ilość nad przekrój na szkiełku i powoli docisnąć do przekroju szkiełkiem nakrywką, unikając pęcherzyków powietrza. Nie przesuwać szkiełka nakrywki aż do całkowitego wyschnięcia, co zajmuje  około 24 h.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Ksylen	Fisher Scientific	X3S-4	Wymieniać ksylen co miesiąc, zależnie od intensywności użytkowania. Ksylen jest TOKSYCZNY.
100% etanol	Fisher Scientific	A406-20	Stosować do przygotowania gradientu EtOH.
DPBS			Modyfikowany przez Dulbecco’ roztwór soli fosforanowo-buforowany Z Ca2+ i Mg2+
Bufor cytrynianowo-sodowy			10 mM, pH 6.5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	Roztwór zapasowy 30% => Rozcieńczyć do 1% w DPBS
Roztwór blokujący			DPBS + 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0.1% azotku sodu + 5% surowicy.
BSA
Azotek sodu			NaAzide
zestaw blokujący awidyna/biotyna	Vector Laboratories	SP-2001
Bufor dla przeciwciał			DPBS + 2% BSA + 0.1% azotku sodu + 2% surowicy (taki sam, jak stosowany w etapie blokowania)
Zestaw ABC Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
Podłoże dla peroksydazy DAB	Vector Laboratories	SK-4100
ddH2O
Hematoksylina	Fisher Scientific	CS401-D	barwienie kontrastowe
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Przedmiotniki i szkiełka cover-slip			szklane