Immunohistochemia: skrawki parafiny przy użyciu zestawu ABC Vectatain firmy Vector Labs

Streszczenie

Immunohistochemia (IHC) jest cenną techniką wykorzystywaną do lokalizacji/wizualizacji ekspresji białka w zamontowanym fragmencie tkanki przy użyciu specyficznych przeciwciał. Istnieją dwie metody: metoda bezpośrednia i pośrednia. W tym eksperymencie opiszemy tylko zastosowanie pośredniego barwienia IHC. Pośrednie barwienie IHC wykorzystuje wysoce specyficzne przeciwciała pierwszorzędowe i drugorzędowe sprzężone z biotyną. Przeciwciała pierwszorzędowe są wykorzystywane do dyskretnej identyfikacji interesujących białek poprzez wiązanie się z określonym epitopem, podczas gdy przeciwciała drugorzędowe odejmują niespecyficzne barwienie tła i wzmacniają sygnał poprzez tworzenie kompleksów z przeciwciałem pierwszorzędowym. Szkiełka mogą być generowane z zamrożonych odcinków lub sekcji zatopionych w parafinie zamontowanych na szkiełkach podstawowych. W tym protokole omówiono przygotowanie skrawków zatopionych w parafinie poprzez odparafinowanie, hydratację za pomocą gradientu alkoholu, indukowane ciepłem odzyskiwanie antygenu oraz blokowanie endogennej aktywności peroksydazy i niespecyficznych miejsc wiązania. Niektóre skrawki są następnie barwione przeciwciałami specyficznymi dla markera limfocytów T CD8, podczas gdy inne są barwione na obecność hydroksylazy tyrozyny. Szkiełka są następnie traktowane odpowiednimi przeciwciałami drugorzędowymi sprzężonymi z biotyną, a następnie opracowywane przy użyciu peroksydazy chrzanowej (HRP) sprzężonej z awidyną z diaminiobenzydyną (DAB) jako substratem. Po opracowaniu prowadnice są barwione przeciwstawnie dla kontrastu i montowane pod szkiełkami nakrywkowymi z permount. Po odpowiednim wyschnięciu preparaty te są gotowe do obrazowania.

Protokół

Barwienie skrawków parafiny

1. Odwoskuj szkiełka z ksylenem (Fisher X3^S-4) 3x po 5 minut (zmieniaj ksylen co miesiąc w zależności od zastosowania, ksylen jest TOKSYCZNY). Użyj naczyń i pokrywek na 20 szkiełek z Fisher nr ref 08-812-1A oraz stojaków dopasowanych do tych naczyń. 200 ml płynu na danie.
2. Nawodnij się przez gradient alkoholu w następujący sposób (zmieniaj gradient co 2 tygodnie):
   • 2x w 100% etanolu (Fisher # A406-20) przez 2 min każdy
   • 2x w 95% etanolu po 2 min każdy
   • 1x w 70% etanolu przez 2 min
   • 1x w 50% etanolu przez 2 min
   • 1x w 30% etanolu przez 2 min
   • 1x ddH₂O przez 2 min
3. Moczyć w DPBS przez 5 minut (DPBS = modyfikowana sól fizjologiczna buforowana fosforanem Dulbecco z Ca²⁺ i Mg²⁺).

Odzyskiwanie antygenu:

1. Podgrzej wstępnie bufor cytrynianu N (10 mM, pH 6,5) w kuchence mikrofalowej.
2. Gotuj szkiełka przez 15 minut w kuchence mikrofalowej. Szkiełka nigdy nie powinny wyschnąć, więc sprawdzaj co minutę i w razie potrzeby dodawaj cytrynian na.
3. Ostudzić w temperaturze pokojowej.
4. Zablokuj aktywność endogennej peroksydazy za pomocą 1%_H2O2w DPBS przez 20 min (1,5 ml 30% zapasu Sigma H-1009 w 50 ml DPBS).
5. Moczyć w DPBS 3 x 5 min.
6. Zablokuj miejsca niespecyficzne przez inkubację przez noc w temperaturze +4°C w DPBS + 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,1% Azydku Na + 5% surowicy.
   
   Uwaga: Wybór surowicy będzie zależał od gatunku, u którego wytworzono przeciwciała użyte do barwienia. Blok z surowicą gatunku, w którym wytworzono drugorzędowy Ab (sprzężony z biotyną). Jeśli nie jest to możliwe, należy użyć surowicy innego gatunku niż ten, w którym wyprodukowano pierwotny Ab.
   
   
7. Zablokuj miejsca biotyny za pomocą zestawu blokującego awidynę/biotynę (katalog laboratoriów wektorowych # SP-2001):
   • Inkubować z Avidin D przez 15 minut. Krótko spłukać DPBS.
   • Inkubować z roztworem biotyny przez 15 minut.
8. Inkubować w pierwotnym Ab przez 2 godziny w temperaturze pokojowej, w DPBS + 2% BSA + 0,1 % Naazydu + 2% surowicy (tak samo jak w przypadku etapu blokowania).
9. Moczyć w PBS 3 x 5 min.
10. Inkubować z drugorzędowym Ab sprzężonym z biotyną przez 1 godzinę w temperaturze pokojowej w DPBS + 2% BSA + 0,1% Na Azide + 2% surowicy (tak samo, jak w przypadku etapu blokowania).
11. W tym samym czasie należy przygotować odczynnik ABC, ponieważ przed użyciem musi on rozwinąć się przez co najmniej 30 minut!! (patrz Materiały)
12. Przygotować w stożkowej tubie o pojemności 50 ml. W 15 ml DPBS (bez surowicy, bez azydku) dodaj 3 krople odczynnika A, wymieszaj i dodaj 3 krople odczynnika B i wymieszaj. Unikaj ściskania butelek, raczej poczekaj, aż krople same się uformują. Zestaw ABC Vectastain PK-6100 firmy Vector Labs.
13. Moczyć w DPBS 3 x 5 min.
14. Inkubować z odczynnikiem ABC przez 30-45 minut w temperaturze pokojowej.
15. Moczyć w DPBS 3 x 5 min.
16. Bezpośrednio przed użyciem przygotować substrat peroksydazy DAB (Vector Labs # SK-4100) w 5 ml ddH₂O w szklanej fiolce (patrz Materiały)
    • 2 krople buforowego roztworu podstawowego, wymieszać
    • 4 krople DAB, wymieszaj (powinny stać się lekko brązowe)
    • 2 krople H₂O₂, wymieszać
17. Upuść podłoże DAB na szkiełka i obserwuj, czy nie ma brązowych plam.
18. Zanurz szkiełka w lodzie + wodzie z kranu, aby zatrzymać reakcję.
19. Płukać pod zimną wodą z kranu przez 5 minut.
20. Barwienie przeciwstawne za pomocą hematoksyliny (20 sek; Fisher CS401-D) i spłucz w wodzie z kranu, aż woda będzie czysta.
21. Odwodnić przez gradient alkoholu, zaczynając od 30% etanolu do 100% etanolu (2 minuty każdy).
22. Moczyć w ksylenie 3 x 5 min.
23. Zamontuj za pomocą Permount (Fisher # SP15-100): umieść trochę nad sekcją na suwaku i powoli dociskaj do sekcji za pomocą szkiełka nakrywkowego bez pęcherzyków powietrza. Nie przesuwaj szkiełka nakrywkowego do całkowitego wyschnięcia, co trwa ~ 24 godziny.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Xylene	Fisher Scientific	X3S-4	Wymieniaj ksylen co miesiąc w zależności od zastosowania. Ksylen jest TOKSYCZNY.
100% etanol	Fisher Scientific	A406-20	Służy do tworzenia gradientu EtOH.
DPBS			Dulbecco" s modyfikowany sól fizjologiczna buforowana fosforanami z buforem
		Na-cytrynianu	10 mM, pH 6,5
H2O2	Sigma-Aldrich	H-1009	30% zapasu => Rozcieńczyć do 1% w roztworze
		blokującym	DPBS DPBS + 5% albuminy surowicy bydlęcej (BSA) + 0,1% Azydku Na + 5% surowicy.
BSA
azydek			sodu Naazyd
awidyny/biotyny	Vector Laboratories	SP-2001
Ab bufor			DPBS + 2% BSA + 0,1% Na Azydek + 2% surowicy (taki sam, jak używany do etapu blokowania)
Zestaw ABC Vectastain PK-6100	Vector Laboratories
Podłoże peroksydazy DAB	Wektor Laboratoria	SK-4100
ddH2O
Hematoxylin	Fisher Scientific	CS401-D	Counterstain,
Permount	Fisher Scientific	SP15-100
Szkiełka i szkiełka