Badanie neuronalnych mechanizmów świadomej i nieświadomej pamięci lękowej za pomocą fMRI

Podsumowanie

Opisano metodologię badania mechanizmów neuronalnych wspierających świadome i nieświadome procesy pamięciowe podczas warunkowania lękowego. Metoda ta wykorzystuje funkcjonalny rezonans magnetyczny do monitorowania poziomu utlenowania krwi (BOLD), reakcję przewodnictwa skóry oraz oczekiwanie bodźca bezwarunkowego podczas pawłowowskiego warunkowania lękowego w celu oceny korelatów neuronalnych odrębnych procesów pamięciowych.

Streszczenie

Pawłowowskie warunkowanie lękowe jest często stosowane w połączeniu z funkcjonalnym obrazowaniem rezonansem magnetycznym (fMRI) u ludzi w celu zbadania neuronalnych podłoży uczenia się asocjacyjnego ^1-5. W badaniach tych istotne jest dostarczenie dowodów behawioralnych na warunkowanie, aby zweryfikować, że różnice w aktywności mózgu są związane z procesem uczenia się i korelują z ludzkim zachowaniem.

Badania nad warunkowaniem lęku często monitorują reakcje autonomiczne (np. reakcję przewodnictwa skóry; SCR) jako wskaźnik uczenia się i pamięci ^6-8. Ponadto inne miary behawioralne mogą dostarczyć cennych informacji na temat procesu uczenia się i/lub innych funkcji poznawczych wpływających na warunkowanie. Na przykład przedmiotem zainteresowania w kilku niedawnych badaniach był wpływ oczekiwań względem bodźca bezwarunkowego (UCS) na ekspresję reakcji uwarunkowanej (CR) i reakcji bezwarunkowej (UCR) ^9-14. Miary SCR oraz oczekiwań UCS były ostatnio stosowane w połączeniu z fMRI w celu zbadania neuronalnych substratów świadomych i nieświadomych procesów uczenia się lęku i pamięci ¹⁵. Chociaż procesy poznawcze te można w pewnym stopniu ocenić po sesji warunkowania, oceny po warunkowaniu nie pozwalają na pomiar oczekiwań w każdej pojedynczej próbie i są podatne na interferencję i zapominanie, a także na inne czynniki, które mogą zniekształcić wyniki ^16,17.

Symultaniczny monitoring odpowiedzi autonomicznych i behawioralnych podczas fMRI zapewnia mechanizm, dzięki któremu można ocenić substraty neuronalne pośredniczące w złożonych relacjach między procesami poznawczymi a odpowiedziami behawioralnymi i autonomicznymi. Jednak monitorowanie odpowiedzi autonomicznych i behawioralnych w środowisku MRI wiąże się z szeregiem problemów praktycznych. W szczególności: 1) standardowy sprzęt do monitorowania behawioralnego i fizjologicznego jest wykonany z materiałów ferromagnetycznych, których nie można bezpiecznie stosować w pobliżu skanera MRI, 2) gdy sprzęt ten znajduje się poza komorą skanowania MRI, kable prowadzące do badanego mogą przenosić zakłócenia RF, które generują artefakty w obrazach mózgu, 3) przełączanie gradientów podczas skanowania może powodować powstanie artefaktów w sygnale przewodnictwa skóry, 4) sygnał fMRI generowany przez wymagania motoryczne odpowiedzi behawioralnych może wymagać odróżnienia od aktywności związanej z badanymi procesami poznawczymi. Każdy z tych problemów można rozwiązać poprzez modyfikacje konfiguracji sprzętu do monitorowania fizjologicznego oraz dodatkowe procedury analizy danych. Przedstawiamy tutaj metodologię symultanicznego monitorowania odpowiedzi autonomicznych i behawioralnych podczas fMRI oraz demonstrujemy zastosowanie tych metod do badania świadomych i nieświadomych procesów pamięciowych podczas warunkowania lękowego.

Protokół

1. Psychofizjologia

System monitorowania fizjologicznego firmy Biopac Systems, Inc. (patrz w Tabeli sprzętu specjalistycznego) nie jest standardowym wyposażeniem w większości placówek obrazowania. Należy zaplanować 15-30 minut przed przybyciem uczestnika na skonfigurowanie monitorowania fizjologicznego oraz pozostałego sprzętu opisanego w tym protokole (Rysunek 1).

1. Podłącz komputer w pokoju sterowania, na którym zainstalowano oprogramowanie do monitorowania fizjologicznego AcqKnowledge (Biopac Systems, Inc.), do modułu Biopac MP150 (MP150WSW) za pomocą standardowego krzyżowego kabla Ethernet (CBLETH2).
2. Podłącz interfejs cyfrowy Biopac Isolated Digital Interface (STP10C) do komputera w pokoju sterowania z oprogramowaniem Presentation (Neurobehavioral Systems, Inc; Albany, CA) za pomocą taśmowego kabla DB25 M/F.
3. Podłącz wzmacniacz Biopac GSR (EDA-10C-MRI) do filtra zakłóceń RF (MRIRFIF) w pokoju sterowania, używając ekranowanego kabla przedłużającego (MECMRI-3).
4. Podłącz filtr zakłóceń RF (MRIRFIF) do ekranowanego kabla przedłużającego (MECMRI-1) znajdującego się wewnątrz komory skanowania MRI.
5. Podłącz ekranowany kabel przedłużający do przewodów z włókna węglowego (LEAD 108), które są przytwierdzone do elektrod radioprzezroczystych (EL508). Uwaga: Skręcanie przewodów w ciasną spiralę redukuje artefakty w danych dotyczących przewodnictwa skóry, które mogą powstać podczas skanowania.
6. Przymocuj radioprzezroczyste elektrody (EL508) do paliczka dystalnego palca środkowego i palca serdecznego lewej ręki uczestnika.
7. Ze względu na specyfikę sprzętu do skanowania, temperatura w komorze MRI jest często ustawiona poniżej 21°C. Przykryj uczestnika kocem, aby utrzymać temperaturę dłoni.

2. Reakcje behawioralne (dżojstik)

1. Podłącz komputer w pokoju sterowania z uruchomionym oprogramowaniem Presentation (Neurobehavioral Systems, Inc; Albany, CA) do jednostki interfejsu fORP dżojstika (Current Designs, Inc; Philadelphia, PA) za pomocą kabla USB-mini.
2. Podłącz kabel światłowodowy do jednostki interfejsu fORP w pokoju sterowania, a następnie przeprowadź kabel przez falowód do komory MRI.
3. Podłącz kabel światłowodowy do dżojstika kompatybilnego z MRI.
4. Poproś uczestników o umieszczenie dżojstika w wygodnej i łatwo dostępnej pozycji.

3. Prezentacja bodźca

1. Podłącz komputer z oprogramowaniem do prezentacji znajdujący się w sterowni do zewnętrznych portów VGA i audio konsoli sterującej IFIS-SA (Invivo Corp., Orlando, FL) (Rysunek 1).
2. Sprawdź połączenia kabli światłowodowych pomiędzy konsolą sterującą IFIS a jednostką interfejsu peryferyjnego IFIS wewnątrz komory MRI, a także połączenia pomiędzy jednostką interfejsu peryferyjnego a jednostką wyświetlania obrazu i dźwięku.
3. Umieść jednostkę wyświetlania obrazu i dźwięku za cewką głowową w taki sposób, aby uczestnik mógł widzieć monitor poprzez lustro przymocowane do cewki głowowej.
4. Połącz skrzynkę interfejsu akustycznego jednostki wyświetlania obrazu i dźwięku z kompatybilnymi z MR słuchawkami stereo systemu IFIS za pomocą rurek winylowych.
5. Zkalibruj głośność bodźców słuchowych za pomocą miernika poziomu ciśnienia akustycznego.

4. Procedura eksperymentalna

1. Poinformuj uczestników, że podczas badania kilka razy zostaną zaprezentowane 2 tony, a ich głośność będzie zmieniać się powyżej i poniżej ich progu percepcyjnego (Rysunek 2).
2. Poinstruuj uczestników, aby naciskali przycisk w obudowie dżojstika natychmiast po usłyszeniu dowolnego z tonów, a następnie aktualizowali swoje oczekiwanie względem otrzymania UCS, przesuwając dżojstik w celu ustawienia pozycji paska oceny w skali od 0 do 10 (Rysunek 3).
3. Poproś uczestników o ocenę oczekiwania na UCS w skali ciągłej od 0 do 10. Poinformuj ich, że ocena 0 oznacza pewność, że UCS nie zostanie zaprezentowany, ocena 50 oznacza niepewność co do tego, czy UCS zostanie zaprezentowany, a ocena 10 oznacza pewność, że UCS zostanie zaprezentowany. Poinstruuj uczestników, aby używali pozostałych wartości na skali do wskazywania oczekiwań pośrednich. Następnie pozwól uczestnikom poćwiczyć ocenianie za pomocą dżojstika.
4. Poddaj uczestników procedurze różnicowego warunkowania lęku, wykorzystując 2 tony (70 & 130 Hz; czas trwania 10s; ITI 20s) jako bodźce warunkowe (CS) oraz głośny biały szum (10dB, 500ms) jako UCS.
5. Zaprezentuj 60 prób CS+ (kończących się równocześnie z UCS) oraz 60 prób CS- (zaprezentowanych bez UCS) w kolejności pseudolosowej, tak aby nie zaprezentowano więcej niż 2 prób tego samego CS pod rząd.
6. Zastosuj kontrabalans tonów służących jako CS+ i CS- pomiędzy uczestnikami.
7. Moduluj głośność CS+ i CS- niezależnie. Dostosuj głośność CS w kolejnej próbie z tym samym CS. Zmniejsz głośność CS o 5dB, jeśli nastąpiło naciśnięcie przycisku (tj. po próbie postrzeżonej). Zwiększ głośność o 5dB, jeśli przycisk nie został naciśnięty (tj. po próbie niepostrzeżonej).

5. Procedura skanowania

1. Należy zebrać standardowe obrazy strukturalne T1 o wysokiej rozdzielczości (np. MPRAGE), które będą służyć jako referencja anatomiczna dla danych funkcjonalnych.
2. Należy przeprowadzić BOLD fMRI całego mózgu podczas procedury warunkowania. Trzydzieści sześć warstw o grubości 4mm powinno być wystarczające do objęcia całego mózgu przy zastosowaniu stosunkowo standardowych parametrów obrazowania (np. TR = 20ms, TE = 30ms, FOV = 24cm, macierz 64x64). Należy zsynchronizować akwizycję fMRI z prezentacją bodźców za pomocą modułu wyzwalającego (trigger box) fMRI.

6. Pozyskiwanie i analiza danych SCR

1. Próbkowanie przewodnictwa skóry z częstotliwością 2 0 Hz przy użyciu oprogramowania AcqKnowledge oraz kompatybilnego z MR systemu monitorowania fizjologicznego Biopac opisanego w sekcji 1.
2. Zastosowanie cyfrowego filtra dolnoprzepustowego Infinite Impulse Response (IIR) o częstotliwości 1 Hz do danych przewodnictwa skóry w celu redukcji artefaktów powstających podczas obrazowania (patrz Rysunek 4).
3. Ponowne próbkowanie danych przewodnictwa skóry z częstotliwością 250 Hz.
4. Obliczenie SCR jako różnicy w poziomie przewodnictwa skóry od momentu wystąpienia odpowiedzi do jej szczytu.
5. Dane SCR mogą zostać poddane transformacji pierwiastkowej w celu normalizacji rozkładu amplitud odpowiedzi przed analizą statystyczną.

7. Pozyskiwanie i analiza danych dotyczących oczekiwań UCS

1. Próbkowanie (40 Hz) i rejestracja danych dotyczących oczekiwania na UCS przy użyciu oprogramowania Presentation.
2. Obliczanie oczekiwania na UCS jako średniej odpowiedzi (próbka 1s) podczas ostatniej sekundy prezentacji CS.

8. Pozyskiwanie i analiza danych fMRI

1. Przeprowadź standardowe przetwarzanie wstępne danych obrazowania mózgu (np. korekcję czasu akwizycji warstw, rejestrację obrazów, wygładzanie przestrzenne) przy użyciu pakietu oprogramowania do analizy obrazowania funkcjonalnego (np. AFNI) ¹⁸).
2. Utwórz standardowe regresory uciążliwości (np. ruchy ciała) oraz regresory oparte na bodźcach dla prób z CS+ i CS- (zarówno w wariantach postrzeganych, jak i niepostrzeganych), a także dla UCS.
3. Stwórz referencyjną falę odpowiedzi motorycznej, która będzie służyć jako regresor zakłóceń w celu uwzględnienia aktywności motorycznej związanej z odpowiedziami polegającymi na naciskaniu przycisków.
   1. Utwórz funkcję stick, która koduje czas reakcji w odpowiedzi na naciśnięcie przycisku.
   2. Spleć funkcję impulsu naciskania przycisku z kanoniczną funkcją odpowiedzi hemodynamicznej (HRF).
4. Stworzyć referencyjną postać fali opartą na odpowiedziach motorycznych, która będzie służyć jako regresor zakłócający w celu uwzględnienia aktywności motorycznej związanej z reakcjami na joysticku.
   1. Utwórz funkcję typu stick (funkcję impulsową), która koduje momenty zmian nachylenia (np. wartości bezwzględnej nachylenia) > 10) ocen oczekiwań w stosunku do UCS.
   2. Splot funkcji nachylenia joysticka z kanoniczną funkcją odpowiedzi hemodynamicznej (HRF).
5. Przeprowadź analizy pierwszego poziomu, wykorzystując wszystkie regresory oparte na bodźcach oraz regresory zakłócające.
6. Przeprowadź analizę wariancji (ANOVA) z powtarzanymi pomiarami na drugim poziomie w celu zidentyfikowania obszarów, w których aktywacja wykazuje główny efekt typu CS, główny efekt percepcji lub interakcję typu CS x percepcja.

9. Reprezentatywne wyniki:

Metodologia przedstawiona w niniejszym opracowaniu zazwyczaj skutkuje stosunkowo wysokimi ocenami oczekiwania UCS podczas postrzeganych prób CS+ oraz niskimi ocenami podczas postrzeganych prób CS- (Rysunek 5) ^10,15,19. Takie wyniki wskazują, że uczestnicy są świadomi zależności CS-UCS. W próbach niepostrzeganych oceny oczekiwania UCS zazwyczaj pozostają bez zmian w stosunku do ocen przed CS. Oczekiwania UCS w tych niepostrzeganych próbach CS+ i CS- zazwyczaj oscylują wokół 50, co wskazuje, że uczestnicy nie są pewni, czy UCS zostanie zaprezentowany ^10,15,19 (Rysunek 5). Ta niezdolność do wygenerowania zróżnicowanych ocen oczekiwania UCS w niepostrzeganych próbach CS+ i CS- wskazuje, że uczestnicy nie są w stanie wyrazić swojej świadomości zależności w niepostrzeganych próbach warunkowania (Rysunek 6). W przeciwieństwie do tego, zmiany w SCR związane z uczeniem się obserwowano zarówno podczas postrzeganych, jak i niepostrzeganych prób warunkowania ^10,15,19. Konkretnie, SCR były większe w odpowiedzi na postrzegany CS+ niż na postrzegany CS-. Podobnie, większe SCR wykazano podczas niepostrzeganych prób CS+ niż podczas niepostrzeganych prób CS- ^10,15,19 (Rysunek 6). Wspólnie te dane behawioralne i autonomiczne wykazują warunkowanie lękiem z towarzyszącą świadomością zależności w próbach postrzeganych oraz warunkowanie lękiem bez świadomości zależności w próbach niepostrzeganych. Badania obrazowania funkcjonalnego z wykorzystaniem tej metodologii wykazały powiązaną z uczeniem się aktywację hipokampa w postrzeganych, ale nie w niepostrzeganych próbach warunkowania ¹⁵ (Rysunek 7). Z kolei zróżnicowana aktywność ciała migdałowatego była obserwowana zarówno w postrzeganych, jak i niepostrzeganych próbach warunkowania ¹⁵. Wyniki te są zgodne z poglądem, że hipokamp wspiera procesy związane ze świadomością zależności, podczas gdy ciało migdałowate wspiera ekspresję CR z obecnością lub bez świadomości.

Rysunek 1. Schemat podstawowego wyposażenia do prezentacji bodźców oraz monitorowania reakcji behawioralnych i psychofizjologicznych. Oprogramowanie do prezentacji służy do wyświetlania bodźców audiowizualnych i monitorowania ocen oczekiwania na UCS, dokonywanych poprzez poruszanie joystickiem prawej ręki. Oprogramowanie AcqKnowledge i sprzęt Biopac są wykorzystywane do monitorowania przewodnictwa skóry lewej ręki. Linie ciągłe (Biopac), pojedynczo przerywane (IFIS Audio-Visual) i podwójnie przerywane (joystick światłowodowy) przedstawiają kable różnych systemów prezentacji bodźców i monitorowania reakcji. Czarne strzałki wskazują kierunek przepływu informacji.

Rycina 2. Bodźce warunkowe. Prezentuj CS+ i CS- w kolejności pseudolosowej w taki sposób, aby nie więcej niż dwie próby z tym samym CS występowały następujących po sobie. Zmieniaj głośność CS+ i CS- niezależnie. Jeśli bodziec CS zostanie dostrzeżony (oznaczony naciśnięciem przycisku), zmniejsz głośność CS o 5 dB w kolejnej próbie z tym samym CS. Jeśli bodziec CS nie zostanie dostrzeżony (brak naciśnięcia przycisku), zwiększ głośność CS o 5 dB w kolejnej próbie z tym samym CS.

Rycina 3. Skala oceny oczekiwania UCS. Poinstruuj uczestników, aby ocenili swoje oczekiwania dotyczące prezentacji UCS w skali od 0 do 10. Wynik 0 oznacza pewność, że UCS nie zostanie zaprezentowany, wynik 100 oznacza pewność, że UCS zostanie zaprezentowany, a wynik 50 odzwierciedla niepewność co do tego, czy UCS zostanie zaprezentowany. Wartości pośrednie powinny być wykorzystywane do wskazania stopniowania oczekiwań względem UCS.

Rycina 4. Porównanie surowych i przefiltrowanych danych dotyczących przewodnictwa skóry. a) Surowe dane dotyczące przewodnictwa skóry zebrane podczas fMRI. b) Dane dotyczące przewodnictwa skóry po zastosowaniu filtru dolnoprzepustowego IIR o częstotliwości 1 Hz.

Rycina 5. Oceny oczekiwań wobec UCS. – Uczestnicy zazwyczaj zgłaszają wysokie oczekiwania wobec UCS w próbach z postrzeganym CS+ oraz niskie oczekiwania w próbach z postrzeganym CS-. Oczekiwania wobec UCS w próbach z niepostrzeganym CS+ i CS- nie różnią się od siebie.

Rysunek 6. Oczekiwanie UCS i SCR. Różnice w oczekiwaniu UCS są zazwyczaj obserwowane w próbach z postrzeganym CS+ i CS-, co wskazuje na to, że uczestnicy są świadomi zależności między bodźcami. W próbach niepostrzeganych oceny oczekiwania UCS zazwyczaj nie różnią się między sobą, co wskazuje, że uczestnicy nie są w stanie wyrazić swojej świadomości tych zależności. W przeciwieństwie do tego, różnice w warunkowanych SCR są zazwyczaj obserwowane zarówno w próbach warunkowania postrzeganych, jak i niepostrzeganych. Takie wyniki odzwierciedlają wyuczoną ekspresję lęku ze świadomością zależności (tj. w próbach postrzeganych) oraz bez niej (tj. w próbach niepostrzeganych).

Rysunek 7. Funkcjonalny rezonans magnetyczny hipokampa i ciała migdałowatego. Odpowiedzi hipokampa są zazwyczaj silniejsze w przypadku bodźca CS+ niż CS- w próbach warunkowania z uświadomionym, a nie nieuświadomionym powiązaniem. Zróżnicowane odpowiedzi ciała migdałowatego są zazwyczaj obserwowane zarówno w próbach warunkowania z uświadomionym, jak i nieuświadomionym powiązaniem. Wyniki te są zgodne z poglądem, że hipokamp wspomaga procesy związane ze świadomością zależności, podczas gdy ciało migdałowate wspomaga ekspresję strachu z udziałem świadomości lub bez niej.

Dyskusja

Opisana tutaj metodologia warunkowania lękowego umożliwia badanie neuronalnych mechanizmów świadomych i nieświadomych procesów pamięci lękowej. Metoda ta wykorzystuje jednoczesne monitorowanie danych behawioralnych, autonomicznych oraz obrazowania fMRI. Monitorowanie reakcji behawioralnych (tj. oczekiwania na UCS) i autonomicznych (tj. SCR) jest krytycznym elementem tej metody. Oczekiwanie na UCS pozwala ocenić świadomość współzależności, podczas gdy SCR stanowi wskaźnik ekspresji CR. Razem te reakcje behawioralne i auto...