Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe kompleksu Mycobacterium tuberculosis dla leków pierwszego i drugiego rzutu przez rozcieńczenie bulionu w formie płytki do mikromiareczkowania

Podsumowanie

Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe Mycobacterium tuberculosis jest trudne, ale kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format płytki do mikromiareczkowania umożliwia testowanie 12 leków przeciwprątkowych i zapewnia minimalne wartości stężenia hamującego (MIC), co pomoże w odpowiednim leczeniu.

Streszczenie

Szybkie wykrycie oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest ważne w wysiłkach zmierzających do kontrolowania wzrostu opornych prątków gruźlica (Mtb). Badanie wrażliwości na środki przeciwdrobnoustrojowe (AspAT) Mtb tradycyjnie przeprowadza się metodą agarową proporcjonalną lub metodą Badanie makrobulionów na urządzeniu takim jak BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) lub BacT/ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Metoda proporcji agaru, choć uważana za "złoty" standard AST, jest pracochłonna i wymaga obliczenia odporności poprzez przeprowadzenie liczenia kolonii na agarze zawierającym lek w porównaniu z agarem bez leku. Jeśli na pożywce zawierającej lek występuje wzrost ≥1% w porównaniu z pożywką wolną od leku, organizm uważa się za oporny na ten lek. Metody makrobulionowe wymagają oprzyrządowania i przetestowania punktu przerwania ("krytycznego") stężeń leków dla leków pierwszego rzutu (izoniazydu, etambutolu, ryfampicyny i pirazynamidu). Opisana tutaj metoda jest dostępna w handlu w formacie 96-dołkowej płytki mikromiareczkowej [MYCOTB (TREK Diagnostics)] i zawiera rosnące stężenia 12 środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w leczeniu gruźlicy, w tym zarówno leków pierwszego (izoniazyd, ryfampicyna, etambutol), jak i leków drugiego rzutu (amikacyna, cykloseryna, etionamid, kanamycyna, moksyfloksacyna, ofloksacyna, kwas para-aminosalicylowy, ryfabutyna i streptomycyna). Pirazynamid, lek pierwszego rzutu, nie jest uwzględniony w płytce do mikromiareczkowania ze względu na konieczność przeprowadzenia kwaśnych warunków testowych. Do zalet systemu mikromiareczkowania należy zarówno łatwość konfiguracji, jak i szybszy czas realizacji (14 dni) w porównaniu z tradycyjną proporcją agaru (21 dni). Ponadto płytkę można ustawić z inokulum przygotowanego przy użyciu bulionu lub stałego podłoża. Ze względu na to, że format płytki do mikromiareczkowania jest nowy, a Mtb stanowi wyjątkowe wyzwanie w zakresie bezpieczeństwa w laboratorium, w niniejszym protokole opisano, jak bezpiecznie ustawiać, inkubować i odczytywać płytkę do mikromiareczkowania.

Protokół

Każde laboratorium musi przeprowadzić ocenę ryzyka we współpracy ze swoim Instytucjonalnym Inspektorem Bezpieczeństwa Biologicznego, aby określić odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego dla przygotowania inokulum i pipetowania inokulum do płytki. W naszym laboratorium stosujemy praktyki laboratoryjne na poziomie bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3) do momentu zaszczepienia płytek mikromiareczkowych i uszczelnienia plastikową uszczelką samoprzylepną. Talerze te są następnie umieszczane w plastikowej torbie, która jest również zgrzewana. Inkubacja i odczyt interpretacyjny płytki mikromiareczkowej odbywa się w laboratorium o poziomie bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).

1. Etykietowanie materiałów

1. Oznacz płytkę z agarem z krwią, trzy płytki Middlebrook 7H10, bulion Middlebrook 7H9, probówkę z koralikami szklanymi z soli fizjologicznej i płytkę do mikromiareczkowania AST odpowiednimi identyfikatorami (np. imię i nazwisko pacjenta, numer dokumentacji medycznej) w BSL2.
2. Oznaczyć agar z krwią i powłokę 7H10 jako "kontrola czystości". Zaleca się okresowe liczenie kolonii inokulum w celu zapewnienia, że w badaniu stosuje się odpowiednie stężenie organizmów. Liczenie kolonii podczas wykonywania będzie musiało mieć dwie tabliczki 7H10 oznaczone jako "1/1 liczba kolonii" i "liczba kolonii 1/50".

2. Technolog przygotowuje się do przejścia do BSL3

1. Do pracy w BSL3 niezbędne są odpowiednie środki ochrony osobistej, w tym fartuch z solidnym przodem, nakrycie głowy, rękawice, ochraniacze na buty i respirator. Każda instytucja powinna opracować własny plan ochrony dróg oddechowych we współpracy z inspektorem higieny przemysłowej swojej instytucji. W naszym laboratorium mamy do dyspozycji kilka masek oddechowych, w tym maski oddechowe z wymuszonym przepływem powietrza (PAPR) i zamontowane półmaski oddechowe N95 z filtrem HEPA.

3. Przygotowanie szafy bezpieczeństwa biologicznego

1. W BSL3 przygotuj szafę bezpieczeństwa biologicznego (BSC), dezynfekując powierzchnię i umieszczając ręcznik papierowy nasączony środkiem dezynfekującym w odległości około 6 cali od panelu odpowietrznika.
2. Po lewej stronie umieść pojemnik na odpady, a po prawej mały neflometr i wirownik.
3. Pętle do zaszczepiania, pipetory i końcówki umieszcza się obok ręcznika papierowego.
4. Na ręczniku papierowym umieścić stojak z organizmem (w bulionie lub na podłożu stałym) i wzorcem McFarland 0,5.

4. Kalibracja nefelometru

1. Umieść rurkę z soli fizjologicznej ze szklanymi koralikami w nefelometrze i ustaw przyrząd na zero za pomocą półfabrykatu z solą fizjologiczną.
2. Umieść wzorzec McFarland 0.5 w nefelometrze i skalibruj zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Przygotowanie Inokulum

1. Pracując w BSC, zeskrob kolonie ze stałego podłoża za pomocą sterylnej pętli do odpowiednio oznakowanej rurki z solą fizjologiczną ze szklanych koralików, aż do uzyskania ≥0,5 wzorca McFarlanda.
2. Sprawdź wzrokowo próbkę i porównaj ją ze standardem McFarland.
3. Wiruj próbkę przez 30-60 sekund.
4. Pozwól inokulum osiąść przez 15 minut (ustaw timer).

6. Inokulacja płytki mikromiareczkowej

1. Wyreguluj inokulum bulionem z soli fizjologicznej za pomocą nefelometru skalibrowanego do McFarland 0.5 w krokach 4.1 i 4.2. Należy to zrobić w ciągu 30 minut (zgodnie ze specyfikacją producenta).
2. Użyj pipetara o pojemności 200 μl i DŁUGIEJ, odpornej na aerozole końcówki pipety, aby usunąć 100 μl inokulum z GÓRNEJ 1/3 probówki z kulkami soli fizjologicznej. Zaszczepić bulion Middlebrook 7H9. Powoli wiruj zaszczepiony bulion 7H9 przez 20 sekund.
3. Wyjąć płytkę do mikromiareczkowania AST z opakowania producenta. NIE używać, jeśli środek osuszający jest niebieski lub jeśli opakowanie foliowe jest uszkodzone.
4. Przygotować probówkę do rozcieńczania w stosunku 1:50 do użycia w późniejszym okresie przygotowania rozcieńczenia w stosunku 1:50, odpipetowując 50 μl sterylnej wody do sterylnej probówki.
5. Ostrożnie wlej inokulum bulionu 7H9 do koryta. UNIKAJ WYTWARZANIA AEROZOLI.
6. Umieść płytkę do mikromiareczkowania AST etykietą skierowaną do siebie.
7. Użyj 12-kanałowego pipetera, aby dodać 100 μl inokulum do każdej studzienki.
8. Przygotować rozcieńczenia do liczenia kolonii:
   1. Rozcieńczenie 1:1 przygotowuje się ze studzienki kontroli dodatniej (H12) poprzez rozprowadzenie 1 μl pętli na płytce 7H10 oznaczonej "1/1".
   2. Rozcieńczenie 1:50 przygotowuje się przez zaszczepienie pętli o stężeniu 1 μl ze studzienki kontroli dodatniej (H12) i zawirowanie jej w probówce za pomocą 50 μl rurki wodnej przygotowanej powyżej. Smugę 1 μl tego rozcieńczenia na płytkę oznaczoną "1/50".
9. Zaszczepić płytki czystości z koryta, pipetując 50 μl na odpowiednio oznakowany agar z krwią i płytkę 7H10 i smugę do izolacji.
10. Umieścić uszczelkę samoprzylepną na płytce do mikromiareczkowania AST. Mocno dociśnij każdą studzienkę, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie, używając białej tylnej części uszczelki. Unikaj zagnieceń.
11. Zdezynfekować płytkę do mikromiareczkowania, przecierając ją ręcznikiem papierowym nasączonym środkiem dezynfekującym o działaniu przeciwgruźliczym, a następnie umieścić płytkę do mikromiareczkowania w plastikowej torbie i zamknąć zgrzewką lub taśmą.
    1. Plastikowa torba służy jako pojemnik dodatkowy, aby zapewnić, że cały bulion jest zawarty w przypadku wycieku lub rozlania płyty głównej.

7. Dezynfekcja materiałów i komora bezpieczeństwa biologicznego

1. Aby uniknąć wytwarzania aerozoli, umieść kolejne koryto na wierzchu zaszczepionego koryta przed delikatnym umieszczeniem go w pojemniku na odpady.
2. Zdezynfekować wszystkie materiały, w tym nefolimetr, wirownik, płytki, probówki itp., przecierając je środkiem dezynfekującym o działaniu przeciwgruźliczym i odczekać odpowiedni czas, aby zapewnić dezynfekcję zgodnie z instrukcjami producenta przed wyjęciem z BSC. Na przykład Prospray, stosowany przez nas środek dezynfekujący przeciw gruźlicy, potrzebuje 15 minut, aby zabić prątki.
3. Umieść pojemnik na odpady w torbie na zagrożenie biologiczne i zamknij przed autoklawowaniem.

8. Inkubacja

1. Płytki należy inkubować z podłożem w dół i należy zachować ostrożność, aby nie rozlać lub nie rozpryskiwać płynu.
2. Inkubować płytkę do mikromiareczkowania AST, 7H10 i płytki z agarem do krwi w inkubatorze o temperaturze 35-37°C z 5-10% CO₂ i 5-10% CO₂ w laboratorium BSL2.
   1. W naszym laboratorium jest to dopuszczalne, ponieważ płytka jest dobrze uszczelniona i znajduje się w szczelnie zamkniętej plastikowej torbie.
3. W inkubatorze nie należy układać więcej niż 2 płytki AST do mikromiareczkowania zgodnie z instrukcjami producenta.

9. Reprezentatywne wyniki

Interpretacja wyników:

Zapieczętowane płytki do mikromiareczkowania AST mogą być odczytywane ręcznie za pomocą lustra jako pomocy lub za pomocą automatycznego czytnika płytek, takiego jak Vizion (TREK Diagnostics). Płytki można badać już po 7 dniach od inokulacji. Zbadaj studzienki kontrolne wzrostu w pozycjach H11 i H12, aby określić, czy są one dodatnie (tj. Czy na dnie studzienki znajduje się osad komórek). Jeśli studzienki kontrolne wzrostu nie są dodatnie, należy ponownie inkubować płytkę i okresowo ponownie badać (np. dzień 10, dzień 14), aż studzienki kontrolne wzrostu będą dodatnie.

1. W lustrze czytamy:
   1. Umieścić szczelnie zapieczętowaną płytkę do mikromiareczkowania AST na platformie;
   2. Odczytać studzienki kontrolne wzrostu po 7 dniach inkubacji; jeśli wynik jest ujemny, ponownie inkubować płytkę do mikromiareczkowania AST;
   3. Jeśli kontrola wzrostu jest akceptowalna, przeczytaj studzienki zawierające lek. Dla każdego leku należy zapisać pierwsze rozcieńczenie, w którym nie ma wzrostu, porównując studzienki leku z kontrolą wzrostu.
   4. Wzrost objawia się zmętnieniem lub osadem komórek na dnie studni.
2. Odczyt instrumentu: postępuj zgodnie z instrukcjami producenta; poniższe instrukcje są przykładem tego, jak odczyt można wykonać za pomocą platformy Vizion:
   1. Zaloguj się.
   2. Użyj oprogramowania płytek AST "MYCOTB".
   3. Umieść zapieczętowaną tabliczkę z kodem kreskowym skierowanym w stronę użytkownika. Wzrost objawia się zmętnieniem lub osadem komórek na dnie studni.
   4. Odczytać dane kontrolne wzrostu; jeśli wynik jest ujemny, należy ponownie wyprowadzić mikropłytkę AST; w przypadku wyniku dodatniego odczytać płytkę, dotykając ekranu pierwszym dołkiem każdego leku, który nie wykazuje wzrostu.

Czytaj tabliczki czystości. Na płytce z agarem z krwią nie powinien występować wzrost po 48 godzinach, a na płytce o czystości 7H10 powinien występować zlewający się wzrost jednego typu organizmu. W przypadku zanieczyszczenia należy powtórzyć test mikromiareczkowania AspAT z czystej hodowli.

Oblicz liczbę kolonii z odwiertu kontroli pozytywnej, korzystając z poniższej tabeli:

Klucz hrabiego kolonii

# kolonie liczone na tabliczki z napisem "1/1" # kolonie policzone na tabliczce z napisem "1/50" Liczba kolonii inokulum (jtk/ml) <50 0 <5 x 10⁴ 50-100 szt. 0-2 5 x 10⁴ do 1 x 10⁵ >100 szt. ≤ 10 1 X 10⁵ do 5 X 10⁵ >100 szt. >10 5 x 10⁵

W niektórych szczepach Mycobacterium tuberculosis może występować ślad z kwasem para-aminosalicylowym. Można to zinterpretować, patrząc na wszystkie studzienki, które mają granulki i używając pierwszej studzienki, która ma ten sam rozmiar osadu, co następne rozcieńczenie, jako punktu końcowego. Oporność jest rzadka w przypadku tego leku.

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki przy użyciu płytki MYCOTB.

Skrót leku lek MIC μ/ml OFL (Język angielski) ofloksacyna 16 Format MXF moksyfloksacyna 8 Rif Ryfampicyna >16 Ami Amikacyna 0,5 Str Streptomycyny 16 Rfb ryfabutyna 8 pas Kwas p-aminosalicylowy ≤0,5 Eth Etionamid 5 (Certyfikat Społeczny) cykloseryna 4 Inh izoniazyd (izoniazyd) cyfra arabska Kan Kanamycyna Rozdział 1.2 Certyfikat EMB etambutol Wersja 4.0

Dyskusja

Przykład płytki do mikromiareczkowania AspAT, która ma dodatnią kontrolę wzrostu, pokazano na rysunku 1, a końcowy wskaźnik MIC (μg/ml) dla każdego leku jest zakreślony. Badanie przeprowadzone w naszym laboratorium wykazało, że metoda mikromiareczkowania AST na płytkach jest równoważna złotej standardowej metodzie proporcji agaru do badania wrażliwości Mycobacterium tuberculosis. Szybsze raportowanie wyników uzyskano przy użyciu płytki mikromiareczkowej AST w porównaniu z tradycyjną metodą proporcji agaru z ostateczną interpretacją dla płytki do mikromiareczkowania AST i metody proporcji agaru odpowiednio po 14 i 21 dniach. Płytka do mikromiareczkowania AST ma tę zaletę, że testuje jednocześnie leki pierwszego i drugiego rzutu, co może pomóc w zapobieganiu nadmiernym opóźnieniom w przypadku opornych szczepów. Płytka do mikromiareczkowania AST jest również znacznie łatwiejsza do ustawienia i odczytu niż APM, a do odczytu płytek można użyć zarówno ręcznego lustra, jak i półautomatycznego systemu, takiego jak VIZION. Dostępność wartości MIC do badania lekooporności gruźlicy może dostarczyć lekarzom cennych nowych informacji w odniesieniu do tradycyjnej wartości stężenia krytycznego, szczególnie w przypadku izolatów z "graniczną" wrażliwością.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Płytki do mikromiareczkowania AST i uszczelka adhezyjna	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	MYCOTB
McFarland 0,5 standard	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	E1041
Płytki Middlebrook 7H10	Fisher Scientific
Płytki agarowe do krwi	Fisher Scientific
Sterylne pętle 1 i mu; L	Fisher Scientific
Sterylne pętle 10 μ L	Fisher Scientific
Sensitititre Saline-Tween bulion z kulek szklanych	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	27143
7H9 OADC Rosół	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	T3440
Długie końcówki do pipet	Fisher Scientific
Sterylne rynny	TREK Diagnostics, Thermo Scientific
M. tuberculosis	ATCC	27294
Pipeters: 1000, 200, 20μ L	Fisher Scientific
Tips 1000, 20, 20 i mu; L	Wielokanałowy pipeter Fisher Scientific
	Inkubator Fisher Scientific
5-10% CO2	Fisher Scientific
Worki plastikowe, małe, CO2 przepuszczalne	Produkty
Środek dezynfekujący TB (taki jak ProSpray C-60)	International, Commerce City, CO	PSC60/32
Czytnik lusterek	Fisher Scientific