Badanie wrażliwości kompleksu Mycobacterium tuberculosis na leki pierwszego i drugiego rzutu metodą rozcieńczeń w bulionie z wykorzystaniem płytek mikrotitracyjnych

Podsumowanie

Badanie wrażliwości Mycobacterium tuberculosis na środki przeciwdrobnoustrojowe jest trudne, lecz kluczowe dla opieki nad pacjentem. Ten format z użyciem płytek mikrotytrujących umożliwia przetestowanie 12 leków przeciwprątkowych i pozwala wyznaczyć wartości minimalnego stężenia hamującego (MIC), co pomoże w doborze odpowiedniego leczenia.

Streszczenie

Szybka detekcja oporności na środki przeciwdrobnoustrojowe jest istotna w wysiłkach na rzecz kontroli wzrostu liczby opornych szczepów Mycobacterium tuberculosis (Mtb). Badania wrażliwości przeciwdrobnoustrojowej (AST) Mtb były tradycyjnie przeprowadzane metodą proporcji na agarze lub testami w makrobulionie przy użyciu urządzeń takich jak BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) lub BacT/ALERT (bioMérieux, Hazelwood, MO). Metoda proporcji na agarze, choć uznawana za „złoty” standard AST, jest pracochłonna i wymaga obliczenia oporności poprzez przeliczanie kolonii na agarze zawierającym lek w porównaniu z agarem bez leku. Jeśli wzrost na podłożu zawierającym lek wynosi ≥1% w porównaniu z podłożem bez leku, organizm uznaje się za oporny na ten lek. Metody w makrobulionie wymagają specjalistycznej aparatury oraz ustalenia krytycznych stężeń leków („punktów odcięcia”) dla leków pierwszego rzutu (izoniazydu, etambutolu, ryfampicyny i pirazynamidu). Metoda opisana w niniejszym opracowaniu jest dostępna komercyjnie w formacie 96-dołkowej płytki mikrotitracyjnej [MYCOTB (TREK Diagnostics)] i zawiera rosnące stężenia 12 środków przeciwdrobnoustrojowych stosowanych w leczeniu gruźlicy, w tym leki pierwszego (izoniazyd, ryfampicyna, etambutol) i drugiego rzutu (amikacyna, cykloseryna, etionamid, kanamycyna, moksyfloksacyna, ofloksacyna, kwas para-aminosalicylowy, ryfabutyna i streptomycyna). Pirazynamid, lek pierwszego rzutu, nie jest zawarty na płytce mikrotitracyjnej ze względu na konieczność zapewnienia kwasowych warunków testowych. Zalety systemu mikrotitracyjnego obejmują zarówno łatwość przygotowania, jak i krótszy czas oczekiwania na wynik (14 dni) w porównaniu z tradycyjną metodą proporcji na agarze (21 dni). Dodatkowo, płytkę można przygotować z inokulum sporządzonym z bulionu lub podłoża stałego. Ponieważ format płytki mikrotitracyjnej jest nowy, a Mtb stwarza wyjątkowe wyzwania w zakresie bezpieczeństwa w laboratorium, niniejszy protokół opisuje sposób bezpiecznego przygotowania, inkubacji i odczytu płytki mikrotitracyjnej.

Protokół

Każde laboratorium powinno przeprowadzić ocenę ryzyka we współpracy z instytucjonalnym inspektorem ds. bezpieczeństwa biologicznego, aby określić odpowiedni poziom bezpieczeństwa biologicznego dla przygotowania inokulum oraz dla pipetowania inokulum do płytki. W naszym laboratorium stosujemy praktyki właściwe dla poziomu bezpieczeństwa biologicznego 3 (BSL3) aż do momentu zaszczepienia płytek mikrotitracyjnych i zamknięcia ich plastikową plombą adhezyjną. Płytki te są następnie umieszczane w plastikowej torebce, która jest zgrzewana termicznie. Inkubacja i odczyt interpretacyjny płytki mikrotitracyjnej są przeprowadzane w laboratorium poziomu bezpieczeństwa biologicznego 2 (BSL2).

1. Etykietowanie materiałów

1. W laboratorium BSL2 opisz płytkę z agarem krwawym, trzy płytki Middlebrook 7H10, bulion Middlebrook 7H9, probówkę z koralikami szklanymi z solą i Tweenem oraz płytkę mikrotytrową AST, wpisując odpowiednie dane identyfikacyjne (np. imię i nazwisko pacjenta, numer historii choroby).
2. Oznacz agar krwawy i płytki 7H10 jako „kontrola czystości”. Zaleca się okresowe przeliczanie kolonii inokulum, aby upewnić się, że w teście zastosowano odpowiednie stężenie drobnoustrojów. W przypadku przeprowadzania przeliczeń kolonii, dwie z płytek 7H10 należy opisać jako „przeliczanie kolonii 1/1” oraz „przeliczanie kolonii 1/50”.

2. Przygotowanie technologa do wejścia do laboratorium BSL3

1. Do pracy w laboratorium poziomu BSL3 niezbędne są odpowiednie środki ochrony indywidualnej, w tym fartuch z pełnym przodem, nakrycie głowy, rękawice, ochraniacze na obuwie oraz respirator. Każda instytucja powinna opracować własny plan ochrony dróg oddechowych we współpracy z instytucjonalnym specjalistą ds. higieny pracy. W naszym laboratorium dostępnych jest kilka rodzajów respiratorów, w tym zasilane respiratory oczyszczające powietrze (PAPRs) oraz dopasowane półmaski z filtrem HEPA N95.

3. Przygotowanie komory bezpiecznej biologicznie

1. W laboratorium BSL3 przygotować komorę z laminarnym przepływem powietrza (BSC), dezynfekując jej powierzchnię i umieszczając ręcznik papierowy nasączony środkiem dezynfekującym w odległości około 6 cali od panelu wentylacyjnego.
2. Po lewej stronie ustawić pojemnik na odpady, a po prawej niewielki nefelometr oraz wortex.
3. Pętle do szczepienia, pipety i końcówki umieścić obok ręcznika papierowego.
4. Na ręczniku papierowym ustawić statyw z organizmem (w bulionie lub na podłożu stałym) oraz wzorzec McFarland 0.5.

4. Kalibracja nefelometru

1. Umieść probówkę z koralikiem szklanym w roztworze soli fizjologicznej z Tweenem w nefelometrze i wyzeruj instrument, używając próbki ślepej z soli fizjologicznej z Tweenem.
2. Umieść wzorzec McFarland 0.5 w nefelometrze i przeprowadź kalibrację zgodnie z instrukcjami producenta.

5. Przygotowanie inokulum

1. Pracując w BSC, zebrać kolonie z podłoża stałego za pomocą sterylnej pętlki do odpowiednio oznakowanej probówki z szklanymi kuleczkami zawierającej roztwór soli fizjologicznej z Tweenem, aż do uzyskania mętności odpowiadającej standardowi McFarland ≥0,5.
2. Przeprowadzić wizualną ocenę próbki i porównać ją ze standardem McFarland.
3. Mieszać próbkę w wirówce vortex przez 30-60 sekund.
4. Pozostawić inokulum do osadzenia na 15 minut (nastawić minutnik).

6. Inokulacja płytki mikrotitracyjnej

1. Dostosuj miano inokulum za pomocą bulionu solno-tweenowego, korzystając z nefelometru skalibrowanego do standardu McFarland 0,5 zgodnie z krokami 4.1 i 4.2. Czynność tę należy wykonać w ciągu 30 minut (zgodnie ze specyfikacją producenta).
2. Użyj a 200 μL pipetkę oraz DŁUGĄ końcówkę do pipetki z filtrem zapobiegającym tworzeniu się aerozoli do usunięcia 100 μL inakulum z górnej 1/3 części^rd z probówki z kuleczkami solnymi i Tweenem. Zaszczepić bulion Middlebrooka 7H9. Zaszczepiony bulion 7H9 powoli mieszać w wortexie przez 20 sekund.
3. Wyjmij płytkę mikrotitracyjną do testów AST z opakowania producenta. NIE używać, jeśli osuszacz ma kolor niebieski lub jeśli opakowanie z folii jest uszkodzone.
4. Przygotować probówkę do rozcieńczenia 1:50, która zostanie wykorzystana później podczas sporządzania rozcieńczenia 1:50 za pomocą pipety 50 μL sterylnej wody do sterylnej probówki.
5. Ostrożnie przelej inokulum w bulionie 7H9 do koryta. UNIKAJ GENEROWANIA AEROZOLI.
6. Umieść płytkę mikrotitracyjną do badania AST etykietą skierowaną w Twoją stronę.
7. Za pomocą pipety 12-kanałowej należy dodać 100 μL inokulum do każdej studzienki.
8. Przygotowanie rozcieńczeń do zliczania kolonii:
   1. Rozcieńczenie 1:1 przygotowuje się poprzez przenoszenie próbki z dołka kontroli pozytywnej (H12). 1 μl pętlą na płytce 7H10 oznakowanej jako „1/1”.
   2. Rozcieńczenie 1/50 przygotowuje się poprzez zaszczepienie 1 μl pętlę z dołka kontroli pozytywnej (H12) i wymieszać ją w probówce z 50 μl z przygotowanej powyżej probówki z wodą. Wykonaj posiew kreskowy 1 μL tego rozcieńczenia na płytkę opisaną jako „1/50”.
9. Zaszczepić płytki do kontroli czystości z koryta za pomocą pipety 50 μL na odpowiednio oznakowane płytki z agarem krwi oraz podłoże 7H10, a następnie wykonać posiew w celu izolacji.
10. Na płytkę mikrotitracyjną AST nałożyć uszczelniającą folię przylepną. Docisnąć mocno każde dołkowanie, korzystając z białej strony folii, aby zapewnić odpowiednie uszczelnienie. Należy unikać powstawania zagięć.
11. Zdezynfekuj płytkę mikrotitracyjną, przecierając ją ręcznikiem papierowym nasączonym środkiem dezynfekcyjnym o działaniu tuberkulocydowym, a następnie umieść płytkę mikrotitracyjną w plastikowej torbie i zamknij ją za pomocą zgrzewarki termicznej lub taśmy.
    1. Plastikowy worek służy jako pojemnik zewnętrzny, aby zapewnić zatrzymanie całej zawartości pożywki w przypadku wycieku lub rozlania z podstawowej płytki.

7. Dezynfekcja materiałów i komory bezpieczeństwa biologicznego

1. Aby uniknąć powstawania aerozoli, na wierzchu zaszczepionej korytka należy położyć drugie korytko, a następnie ostrożnie umieścić je w pojemniku na odpady.
2. Wszystkie materiały, w tym nefelometr, wstrząsarkę, płytki, probówki itp., należy zdezynfekować, przecierając je środkiem dezynfekcyjnym o działaniu przeciwprątkowym, a następnie odczekać odpowiedni czas w celu zapewnienia dezynfekcji zgodnie z instrukcją producenta przed wyjęciem z BSC. Na przykład stosowany przez nas środek przeciwprątkowy Prospray wymaga 15 minut do zniszczenia prątków.
3. Pojemnik na odpady należy umieścić w worku na odpady biologiczne i szczelnie zamknąć przed autoklawowaniem.

8. Inkubacja

1. Płytki należy inkubować stroną z pożywką do dołu, zachowując ostrożność, aby uniknąć rozlania lub rozpryskania cieczy.
2. Inkubować płytkę mikrotitracyjną do AST, podłoża 7H10 oraz płytki z agarem krwi w temperaturze 35-37°C inkubator z 5-10% CO2₂ z dodatkiem 5-10% CO₂ w laboratorium poziomu BSL2.
   1. W naszym laboratorium jest to dopuszczalne, ponieważ płytka jest szczelnie zamknięta i znajduje się w zamkniętej plastikowej torbie.
3. Zgodnie z instrukcjami producenta, w inkubatorze nie należy układać w stosie więcej niż 2 mikrotitracyjnych płytek AST.

9. Reprezentatywne wyniki

Interpretacja wyników:

Zapieczętowane płytki mikrotitracyjne AST można odczytywać ręcznie, wspomagając się lustrem, lub za pomocą automatycznego czytnika płytek, takiego jak Vizion (TREK Diagnostics). Płytki można badać już 7 dni po inokulacji. Należy sprawdzić studzienki kontroli wzrostu w pozycjach H11 i H12, aby określić, czy są one dodatnie (tj. czy na dnie studzienki znajduje się osad komórkowy). Jeśli studzienki kontroli wzrostu nie są dodatnie, płytkę należy ponownie inkubować i okresowo badać (np. w 10. dniu, 14. dniu), aż studzienki kontroli wzrostu staną się dodatnie.

1. Odczyt metodą lustrzaną:
   1. Umieść zamkniętą płytkę mikrotitracyjną AST na platformie;
   2. Odczytaj dołki kontroli wzrostu po 7 dniach inkubacji; jeśli wynik jest negatywny, poddaj płytkę mikrotitracyjną AST ponownej inkubacji;
   3. Jeśli kontrole wzrostu są akceptowalne, odczytaj dołki zawierające lek. Dla każdego leku zapisz pierwsze rozcieńczenie, w którym nie stwierdzono wzrostu, porównując dołki z lekiem z kontrolą wzrostu.
   4. Wzrost objawia się jako zmętnienie lub osad komórek na dnie dołka.
2. Odczyt instrumentalny: postępuj zgodnie z instrukcjami producenta; poniższe instrukcje są przykładem sposobu wykonania odczytu na platformie Vizion:
   1. Zaloguj się.
   2. Użyj oprogramowania do płytek AST „MYCOTB”.
   3. Umieść zamkniętą płytkę kodem kreskowym skierowanym w stronę użytkownika. Wzrost objawia się jako zmętnienie lub osad komórek na dnie dołka.
   4. Odczytaj kontrole wzrostu; jeśli wynik jest negatywny, poddaj płytkę mikrotitracyjną AST ponownej inkubacji; jeśli wynik jest pozytywny, odczytaj płytkę, dotykając ekranu w miejscu pierwszego dołka dla każdego leku, w którym nie występuje wzrost.

Odczytaj płyty czystości. Płyta z agarem krwi nie powinna wykazywać wzrostu po 48 godzinach, a płyta czystości 7H10 powinna wykazywać zlewne wzrost jednego typu organizmu. W przypadku zanieczyszczenia test mikrotitracyjny AST musi zostać powtórzony z czystej kultury.

Oblicz liczbę kolonii w studzience kontroli pozytywnej, korzystając z poniższej tabeli:

Klucz do liczenia kolonii

Liczba kolonii policzonych na płytce oznaczonej jako „1/1”	Liczba kolonii policzonych na płytce oznaczonej jako „1/50”	Liczba kolonii w inokulum (cfu/mL)
<50	0	<5 X 104
50-100	0-2	5 X 104 do 1 X 105
>100	≤ 10	1 X 105 do 5 X 105
>100	>10	>5 X 105

W niektórych szczepach Mycobacterium tuberculosis może występować zjawisko rozmycia (trailing) w przypadku kwasu p-aminosalicylowego. Można to zinterpretować, analizując wszystkie studzienki zawierające osad i przyjmując za punkt końcowy pierwszą studzienkę, w której osad ma taką samą wielkość jak w kolejnym rozcieńczeniu. Oporność na ten lek występuje rzadko.

Rysunek 1. Reprezentatywne wyniki uzyskane przy użyciu płytki MYCOTB.

Skrót nazwy leku	Lek	MIC μ/ml
OFL	ofloksacyna	16
MXF	moksiflocacyna	8
RIF	ryfampicyna	>16
AMI	amikacyna	0.5
STR	streptomycyna	16
RFB	rifabutyna	8
PAS	kwas p-aminosalicylowy	≤0.5
ETH	etionamid	5
CYC	cykloseryna	4
INH	izoniazyd	2
KAN	kanamycyna	1.2
EMB	etambutol	4.0

Dyskusja

Przykład płytki mikrotytracyjnej do AST z dodatnimi kontrolami wzrostu przedstawiono na Rysunku 1, gdzie zaznaczono końcowe MIC (μg/ml) dla każdego leku. Badanie przeprowadzone w naszym laboratorium wykazało, że metoda płytki mikrotytracyjnej AST jest równoważna ze złotym standardem, jakim jest metoda proporcji na agarze, w badaniu wrażliwości Mycobacterium tuberculosis. Szybsze raportowanie wyników uzyskano przy zastosowaniu płytki mikrotytracyjnej AST w porównaniu z tradycyjną metodą proporcji na agarze, przy czym ostateczna interpretacja dla płytki mikrotytracyjnej AST i metody proporcji na agarze nastąpiła odpowiednio w 14. i 21. dniu. Płytka mikrotytracyjna AST daje możliwość jednoczesnego testowania leków pierwszego i drugiego rzutu, co może pomóc zapobiec nadmiernym opóźnieniom w przypadku szczepów opornych. Płytka mikrotytracyjna AST jest również znacznie łatwiejsza w przygotowaniu i odczycie niż APM; do odczytu płytek można użyć zarówno ręcznego lusterka, jak i systemu półautomatycznego, takiego jak VIZION. Dostępność wartości MIC w badaniu oporności prątków gruźlicy na leki może dostarczyć lekarzom cennych nowych informacji w porównaniu z tradycyjną wartością stężenia krytycznego, zwłaszcza w przypadku izolatów o wrażliwości „granicznej”.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
płytki mikrotitracyjne do AST i uszczelka adhezyjna	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	MYCOTB
standard McFarland 0,5	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	E1041
płytki z podłożem Middlebrook 7H10	Fisher Scientific
Płytki z agarem krwi	Fisher Scientific
Pętliki sterylne 1 μL	Fisher Scientific
Pętle sterylne 10 μL	Fisher Scientific
Bulion z szklanymi kuleczkami Sensititre Saline-Tween	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	27143
Bulion 7H9 OADC	TREK Diagnostics, Thermo Scientific	T3440
Długie końcówki do pipet	Fisher Scientific
Sterylne korytka	TREK Diagnostics, Thermo Scientific
*M. tuberculosis*	ATCC	27294
Pipety: 1000, 200, 20μL	Fisher Scientific
końcówki 1000, 20, 20 μL	Fisher Scientific
Pipeta wielokanałowa	Fisher Scientific
Inkubator 5-10% CO22	Fisher Scientific
Worki plastikowe, małe, CO2 przepuszczalny	Wyroby z tworzyw sztucznych
środek dezynfekcyjny do zwalczania prątków gruźlicy (np. ProSpray C-60)	Certol International, Commerce City, CO	PSC60/32
Czytnik Mirror Box	Fisher Scientific