Kwantyfikacja upośledzenia funkcji poznawczych spowodowanego radioterapią czaszki

Podsumowanie

Upośledzenie poznawcze wynikające z radioterapii guzów mózgu stanowi klinicznie trudny do leczenia stan, który negatywnie wpływa na jakość życia. Zdolność do krytycznej oceny potencjalnych interwencji mających na celu złagodzenie wywołanych promieniowaniem deficytów poznawczych zależy w ostateczności od możliwości przeprowadzenia rygorystycznych ilościowych ocen funkcji poznawczych.

Streszczenie

Poza kwestią przeżywalności, upośledzenie funkcji poznawczych wynikające z klinicznego leczenia nowotworów jest głównym czynnikiem determinującym efekt terapeutyczny. Dla wielu pacjentów cierpiących na nowotwory OUN oraz nowotwory pozamózgowe radioterapia i chemioterapia stanowią najlepsze opcje kontroli choroby. Leczenie to wiąże się jednak z kosztami i niemal wszyscy pacjenci po nowotworach (~11 milionów w samych Stanach Zjednoczonych według danych z 2006 roku) są narażeni na ryzyko rozwoju dysfunkcji poznawczych, przy czym najcięższe przypadki występują u pacjentów poddawanych radioterapii czaszki (~200 000/rok) w celu kontroli pierwotnych i przerzutowych guzów mózgu¹. Szczególnie problematyczne są przypadki pediatryczne, w których długotrwałe przeżycie obarczone wyraźnym pogorszeniem funkcji poznawczych prowadzi do znacznych obciążeń społeczno-ekonomicznych². Do dziś nie opracowano satysfakcjonujących rozwiązań tego istotnego problemu klinicznego.

Podjęliśmy próbę rozwiązania tego poważnego problemu zdrowotnego, wykorzystując przeszczepione komórki macierzyste do walki z indukowanym promieniowaniem upośledzeniem funkcji poznawczych u szczurów atymicznych poddanych napromieniowaniu czaszki³. Szczegóły dotyczące napromieniowania stereotaktycznego oraz hodowli in vitro i transplantacji ludzkich neuronalnych komórek macierzystych (hNSCs) można znaleźć w naszej publikacji towarzyszącej (Acharya et al., JoVE reference). Po napromieniowaniu i operacji transplantacji, u szczurów oceniano zmiany w funkcjach poznawczych, przeżywalność przeszczepionych komórek oraz ekspresję markerów specyficznych dla różnicowania w 1. i 4. miesiącu po napromieniowaniu. Aby rzetelnie ocenić sukces lub niepowodzenie potencjalnej interwencji mającej na celu złagodzenie powikłań poznawczych wywołanych promieniowaniem, należy przeprowadzić rygorystyczną serię ilościowych zadań poznawczych. W tym celu poddaliśmy zwierzęta zestawowi paradygmatów testów poznawczych, w tym testowi rozpoznawania nowych miejsc, labiryntowi wodnemu, labiryntowi w kształcie krzyża oraz warunkowaniu lękowemu, aby ilościowo ocenić uczenie się i pamięć hipokampalną oraz pozahipokampalną. Wykazaliśmy przydatność tych testów w ilościowym określaniu specyficznych rodzajów ubytków poznawczych u napromieniowanych zwierząt i wykorzystaliśmy je do wykazania, że zwierzęta z przeszczepionymi hNSCs wykazują znaczną poprawę funkcji poznawczych³.

Korzyści poznawcze wynikające z przeszczepienia ludzkich komórek macierzystych sugerują, że podobne strategie mogą w przyszłości zapewnić niezbędną pomoc kliniczną osobom, które przeżyły nowotwór i cierpią na zaburzenia funkcji poznawczych. W związku z tym przygotowaliśmy pisemną i wizualną dokumentację kluczowych etapów wykorzystanych w naszych paradygmatach testów poznawczych, aby ułatwić wdrożenie naszych obiecujących wyników do praktyki klinicznej.

Protokół

Nasze schematy testów poznawczych przedstawiono na Rycini 1. Testy poznawcze rozpoczyna się miesiąc po naświetlaniu i wykonaniu procedur chirurgicznych.

Przeprowadzanie zadania rozpoznawania nowych miejsc (NPR)

1. Zadanie rozpoznawania nowych miejsc (Novel Place Recognition, NPR) opiera się na procedurach opisanych przez Mumby i współpracowników (2002) i jest zadaniem badania pamięci przestrzennej zależnym od hipokampa⁴.
2. Szczury są najpierw oswajane z kontekstem badawczym poprzez umieszczanie ich w arenach testowych (wykonane na zamówienie, białe, akrylowe pudełka z otwartą górą, 70cm X 70cm X 40cm wysokości) przez 20 minut raz dziennie przez trzy dni. Podczas tych sesji habituacji w arenach umieszcza się przedmioty, które nie będą wykorzystywane w późniejszych testach.
3. W fazie habituacji należy odnotować manualne obserwacje zachowań eksploracyjnych, natomiast rejestracja i śledzenie zachowania nie są konieczne.
4. W każdej fazie zadania NPR areny są dokładnie czyszczone pomiędzy zwierzętami przy użyciu 70% etanolu, aby zminimalizować zakłócający wpływ sygnałów zapachowych. We wszystkich próbach eksperymentatorzy umieszczają zwierzęta w centrum aren testowych w stałej orientacji, aby zminimalizować ryzyko, że zwierzęta będą eksplorować po prostu blok, obok którego zostały umieszczone.
5. Fazę zapoznawczą oraz 5-minutową fazę testową przeprowadza się w czwartym dniu.
6. W fazie zapoznawczej dwa identyczne plastikowe bloki (8cm X 3cm X 10cm wysokości), dokładnie oczyszczone 70% etanolem, umieszcza się w określonych pozycjach wewnątrz aren testowych. Jedno zwierzę umieszcza się w każdej arenie na 5 minut, pozwalając mu na swobodną eksplorację.
7. Eksplorację dwóch równo znanych pozycji przestrzennych ocenia się za pomocą zautomatyzowanego systemu śledzenia. We wszystkich fazach eksplorację definiuje się jako sytuację, w której czubek nosa zwierzęcia znajduje się w promieniu 4cm od bloków i jest skierowany w ich stronę.
8. Po fazie zapoznawczej zwierzęta są umieszczane w małej klatce przejściowej na 5-minutowy okres odroczenia. W tym czasie areny testowe są czyszczone 70% etanolem i dodawane są identyczne kopie bloków: jedna w tej samej pozycji przestrzennej, co w fazie zapoznawczej, oraz jedna w nowej pozycji przestrzennej. Jeśli szczur pamięta układ przestrzenny bloków z fazy zapoznawczej, poświęci więcej czasu na eksplorację bloku znajdującego się w nowym miejscu.
9. Po 5-minutowym odstępie czasowym zwierzęta są ponownie wprowadzane do aren testowych na 5-minutową fazę testową. Eksplorują one swobodnie przez 3 minuty.
10. 24 godziny po zakończeniu fazy zapoznawczej zwierzęta są ponownie wprowadzane do aren testowych na 24-godzinną fazę testową. W tej fazie jeden blok pozostaje w tej samej pozycji, co podczas fazy zapoznawczej i 5-minutowej fazy testowej, a drugi blok zostaje umieszczony w nowej, nieznanej pozycji przestrzennej. Ponownie, jeśli szczur pamięta układ przestrzenny bloków z fazy zapoznawczej z dnia poprzedniego, poświęci więcej czasu na eksplorację bloku znajdującego się w nowym miejscu.
11. Następnie, za pomocą zautomatyzowanego programu śledzenia, gromadzi się dane dotyczące czasu poświęconego na eksplorację bloków w różnych pozycjach przestrzennych, które mogą być analizowane statystycznie w celu znalezienia różnic między grupami eksperymentalnymi.
12. Dla fazy zapoznawczej oblicza się całkowity czas poświęcony na eksplorację obu lokalizacji przestrzennych w trakcie całej próby. W tej fazie nie powinno być różnic w czasie eksploracji obu lokalizacji, ponieważ są one dla zwierząt tak samo znane/nieznane (Ryc. 2A). Ponadto, istotne różnice w całkowitej eksploracji między grupami eksperymentalnymi mogą wskazywać na różnice grupowe w motywacji do eksploracji lub poziomach lęku i powinny być uwzględnione przy interpretacji wyników pamięci rozpoznawania przestrzennego z dwóch faz testowych.
13. Dla obu faz testowych (5-minutowej i 24-godzinnej) oblicza się wskaźnik eksploracji według wzoru: (czas eksploracji nowej pozycji - czas eksploracji znanej pozycji) / całkowity czas eksploracji (Ryc. 2B). W ten sposób uwzględnia się indywidualną zmienność motywacji do eksploracji obiektów. Zwierzęta zdrowe poświęcają znacząco więcej czasu na eksplorację nowej pozycji przestrzennej, niż wynikałoby to z przypadku (oznaczone linią przerywaną) po 5-minutowych i 24-godzinnych odstępach czasowych (Ryc. 2B).
14. Wskaźnik eksploracji jest zazwyczaj obliczany dla pierwszych 60 sekund testów 5-minutowych i 24-godzinnych⁴. Wynika to z faktu, że w miarę postępu prób testowych nowa pozycja przestrzenna staje się dla zwierząt bardziej znana. Zatem pierwsza minuta prób testowych zapewnia najdokładniejszą ocenę pamięci rozpoznawania przestrzennego.

2. Przeprowadzenie testu w labiryncie krzyżowym (EPM)

1. Zadanie w labiryncie krzyża podniesionego (EPM) opiera się na procedurach opisanych przez Walfa i Frye'a z 2007 roku⁵.
2. Zadanie EPM służy do oceny lęku u gryzoni. Aparatura EPM to labirynt czteroramienny (45" X 4") wyniesiony na wysokość 45" nad poziom podłogi, z ramionami ułożonymi w kształcie krzyża. Dwa ramiona są zamknięte, a dwa otwarte. Przedstawiona aparatura została wyprodukowana przez Med Associates Inc.
3. Zachowanie podczas tego zadania odzwierciedla konflikt między naturalną motywacją szczura do eksploracji nowych środowisk (czas spędzony w ramionach otwartych) a preferencją pozostawania w obszarach chronionych (ramiona zamknięte).
4. Pomieszczenie eksperymentalne jest silnie oświetlone reflektorami skierowanymi na labirynt, aby zapewnić odpowiednią motywację do preferowania zamkniętych, słabiej oświetlonych ramion.
5. Labirynt jest dokładnie czyszczony przed przetestowaniem pierwszego zwierzęcia oraz pomiędzy każdą próbą.
6. Zwierzę umieszcza się w aparaturze, trzymając je pod przednimi kończynami i kładąc w centralnej części labiryntu, przodem do ramienia otwartego, które znajduje się dalej od eksperymentatora. Każda próba trwa 5 minut.
7. Ścieżka zwierzęcia jest śledzona za pomocą zautomatyzowanego oprogramowania do trackingu, aby można było obliczyć liczbę wejść oraz czas spędzony w ramionach otwartych i zamkniętych. Można monitorować dodatkowe zachowania, takie jak wspieranie się na tylnych łapach, pielęgnacja ciała i pochylanie głowy poza krawędź aparatury. Wejście jest liczone, gdy punkt centralny zwierzęcia przekroczy granicę ramienia.
8. Jeśli szczur spadnie z labiryntu, jest on szybko umieszczany z powrotem w ramieniu otwartym, z którego spadł, a zdarzenie to jest odnotowywane w notesie obserwacyjnym. Jeśli szczur zamrze na dłuższy czas, zachowanie to wraz z ewentualnymi przyczynami (np. nagły, głośny hałas poza pomieszczeniem testowym) zostaje odnotowane, a testowanie jest kontynuowane, aby wszystkie zwierzęta eksperymentalne miały podobny czas ekspozycji.
9. Czas spędzony w ramionach otwartych w stosunku do zamkniętych jest wykorzystywany do obliczenia współczynnika: czas w ramionach otwartych / całkowity czas w ramionach. Podobnie oblicza się stosunek wejść do ramion otwartych do całkowitej liczby wejść do ramion. Przy użyciu zautomatyzowanego oprogramowania do trackingu można również zmierzyć całkowity przebyty dystans i prędkość, aby ocenić różnice w funkcjach motorycznych pomiędzy grupami eksperymentalnymi.
10. Zmniejszony lęk wiąże się z większą proporcją czasu spędzonego w ramionach otwartych, natomiast zwiększony lęk i strach wiążą się z dłuższym czasem spędzonym w ramionach zamkniętych. Zwierzęta zdrowe spędzają w ramionach otwartych znacznie mniej czasu, niż wynikałoby to z przypadku (oznaczone linią przerywaną, Rys. 3). Zwierzęta bardziej lękliwe będą spędzać proporcjonalnie mniej czasu w ramionach otwartych, natomiast zwierzęta mniej lękliwe będą spędzać w nich więcej czasu (na przykład po wielokrotnej ekspozycji na labirynt lub po podaniu leku przeciwlękowego).

3. Przeprowadzenie zadania kontekstowego i sygnałowego warunkowania lękowego (FC)

1. Opisy zadań warunkowania lękowego (FC) kontekstowego i sygnałowego opierają się na procedurach według Schafe et al., 1999, Winocur et al., 2006 oraz MacLeod et al., 2007^6-8.
2. Zadanie warunkowania lękowego (FC) to paradygmat behawioralny, w którym zwierzęta uczą się lękać wcześniej neutralnego bodźca (kontekstu, światła lub tonu; bodziec warunkowany) poprzez parowanie go z bodźcem awersyjnym (zazwyczaj łagodnym wstrząsem elektrycznym stopy; bodziec bezwarunkowy). Uczeniu towarzyszy szybka i silna reakcja o długim czasie trwania, dlatego zadanie FC jest często stosowane do badania obwodów neurobiologicznych uczenia się i pamięci u gryzoni.
3. Aparatura do FC to zamknięta komora o wymiarach 30cm X 30cm X 40cm wysokości (Phenotyper, Model 3000, Noldus Information Technology). Podłogę komory stanowi kratka ze stali nierdzewnej, służąca do podawania bodźca w postaci wstrząsu. Phenotyper jest wyposażony w głośnik emitujący na żądanie ton o częstotliwości 2300Hz i natężeniu 90dB, który pełni rolę bodźca warunkowanego.
4. Wstrząs jest podawany za pomocą generatora impulsów (Med Associates Inc.). Wstrząs powoduje chwilowy dyskomfort, który nie wywołuje trwałego bólu ani uszkodzeń tkanek. Zarówno w próbach treningowych, jak i testowych, czas podawania bodźców w postaci wstrząsu i tonu jest kontrolowany automatycznie przy użyciu modułu Trial and Hardware Control Module (wersja 7.0; Noldus Information Technology) będącego rozszerzeniem Ethovision XT.
5. Pierwszego dnia przeprowadzany jest trening FC. Phenotyper jest dokładnie czyszczony 70% ethanolem, a następnie do komory umieszcza się pojedyncze zwierzę. Próba treningowa składa się z trzech faz: (1) fazy bazowej, w której nie podaje się wstrząsu ani tonu, (2) fazy treningowej, w której prezentowane są pary ton-wstrząs, oraz (3) fazy po treningu, w której nie podaje się wstrząsu ani tonu. Każda faza trwa około 5 minut, co daje łączny czas próby treningowej 15 minut na zwierzę.
6. W fazie treningowej ton jest emitowany przez 30 sekund, a w momencie jego zakończenia przez 1 sekundę podawany jest wstrząs o natężeniu 1mA do kratki. Takie parowanie ton-wstrząs jest powtarzane łącznie 5 razy, z zastosowaniem zmiennych odstępów czasowych od 10 do 60 sekund między kolejnymi parami.
7. W fazie treningowej mierzony jest procent czasu, przez który każde zwierzę pozostaje w bezruchu (tzw. freezing), obliczany z ostatnich 60 sekund początkowej fazy bazowej (aby ustalić poziom spontanicznego freezingu przed parowaniem ton-wstrząs) oraz z ostatnich 60 sekund fazy po treningu (aby ustalić zachowanie freezing w odpowiedzi na parowanie ton-wstrząs). Zdrowe zwierzęta wykazują bardzo niski poziom freezingu w fazie bazowej i bardzo wysoki poziom (~95%) w fazie po treningu (Rys. 4).
8. Po 24 godzinach zwierzę jest ponownie umieszczane w identycznym kontekście i obserwowane podczas 5-minutowego testu kontekstowego FC. W tej fazie nie podaje się wstrząsu ani tonu, a procent czasu spędzonego w stanie freezing jest obliczany dla całej próby. Należy zwrócić uwagę na konieczność zachowania stałości kontekstu od treningu do testu kontekstowego. W rzeczywistości niezbędne jest, aby zwierzęta w oba dni były obsługiwane i testowane przez tego samego eksperymentatora. Zdrowe zwierzęta spędzają około 70% czasu próby kontekstowej w stanie freezing (Rys. 4).
9. Test sygnałowy FC jest przeprowadzany godzinę później. Kontekst komory jest zmieniany poprzez usunięcie podłogi z kratki, dodanie paneli na zewnątrz komory oraz umycie podłogi pachnącym środkiem czyszczącym do domu. Zachowanie freezing zwierzęcia jest obserwowane przez pierwszą minutę; poziomy freezing są bardzo niskie, jeśli kontekst został wystarczająco zmieniony (Rys. 4). Następnie przez 3 minuty emitowany jest ton, po czym następuje ostatnia minuta ciszy i obliczany jest procent czasu spędzonego w stanie freezing. Zdrowe zwierzęta wykazują w tym czasie wysoki poziom freezing (Rys. 4).
10. Łącznie zbierane są 5 oddzielnych pomiarów zachowania freezing: (1) bazowy; (2) po treningu; (3) test kontekstowy; (4) test przed sygnałem; (5) test podczas i po sygnale.
11. Brak freezingu w fazie bazowej wskazuje na prawidłowy poziom lęku, natomiast znaczny freezing w fazie po treningu sugeruje zachowane zdolności sensoryczno-motoryczne. Freezing podczas testu kontekstowego potwierdza 24-godzinną pamięć kontekstu treningowego, co zależy od prawidłowego funkcjonowania hipokampa i ciała migdałowatego⁹. Brak freezingu w teście przed sygnałem sugeruje wystarczającą zmianę początkowego kontekstu treningowego. Freezing podczas i po sygnale potwierdza 24-godzinną pamięć bodźca dźwiękowego, co zależy od prawidłowego funkcjonowania ciała migdałowatego⁹.

4. Przeprowadzenie zadania w labiryncie wodnym Morrisa (MWM)

1. Procedury testu w labiryncie wodnym Morrisa opierają się na wcześniejszych opisach^10,11.
2. Test w labiryncie wodnym Morrisa (MWM) jest testem uczenia się przestrzennego u gryzoni, który wymaga wykorzystania wskazówek dystalnych do zlokalizowania zanurzonej platformy ucieczkowej w dużym basenie z nieprzezroczystą wodą. Duże, wyraźne wskazówki wizualne są rozmieszczone wokół basenu w określonych, stałych miejscach. Zwierzęta uczą się korzystać z tych wskazówek, aby dotrzeć do zanurzonej platformy. Zwierzęta są monitorowane i wyjmowane z wody, jeśli nie są w stanie płynąć.
3. Uczenie się przestrzenne jest oceniane w serii powtarzalnych prób, a pamięć referencyjna jest określana poprzez ocenę preferencji obszaru platformy w sytuacji, gdy platforma jest nieobecna. Próby odwrócenia (reversal trials) zwiększają wykrywalność zaburzeń przestrzennych i mogą obciążać dodatkowe obszary mózgu, takie jak kora czołowa¹⁰.
4. Test MWM jest przeprowadzany w ciągu 8 dni i składa się z 4 faz: testu z sygnałem (cued test), fazy nabywania (acquisition phase), 24-godzinnego testu sondowania (probe test) oraz testu uczenia się odwrócenia.
5. Basen to wykonany na zamówienie biały zbiornik z polietylenu o średnicy 200 cm i wysokości 60 cm. Jest on wypełniony wodą do głębokości około 30 cm i uczyniony nieprzezroczystym za pomocą białej, nietoksycznej farby. Temperaturę wody utrzymuje się w przedziale od 20 do 22°C (68 i 72°F). Platforma ucieczkowa to wykonany na zamówienie, przezroczysty plastikowy stojak z okrągłym blatem o średnicy 10 cm. Znajduje się ona około 1,5 cm poniżej powierzchni wody.
6. Test z sygnałem składa się z 4 prób przeprowadzanych w 1. dniu. W tych próbach na środku platformy umieszcza się wyraźną czarno-białą flagę, tak aby miejsce ucieczki było oczywiste dla zwierząt. Aby zminimalizować wykorzystanie informacji przestrzennych w tej fazie, usuwa się wskazówki ścienne, a położenie platformy i punkty startowe zmieniają się z próby na próbę. Faza ta pomaga wykluczyć wszelkie różnice sensoryczno-motoryczne między grupami eksperymentalnymi przed rozpoczęciem fazy nabywania.
7. W każdej fazie testu MWM zwierzęta są trzymane za przednie kończyny i delikatnie umieszczane w wodzie w wyznaczonym punkcie startowym, przodem do ścianki basenu. Zwierzęta są badane w kohortach po 8 osobników, tak aby między każdą z 4 codziennych prób występował 8-10 minutowy odstęp. Podczas przerw między próbami zwierzęta są przetrzymywane w klatkach grzewczych, aby uniknąć hipotermii.
8. W teście z sygnałem dopuszczalny maksymalny czas płynięcia zwierzęcia, aby wspięło się na platformę, wynosi 30 sekund. Jeśli maksymalny czas zostanie osiągnięty przed ucieczką zwierzęcia, eksperymentator prowadzi je do platformy ręcznie i kładzie na niej. Zwierzę pozostaje na platformie przez 20-sekundowy okres odpoczynku przed przeniesieniem do klatki grzewczej.
9. W każdej próbie testu z sygnałem zwierzę startuje z innego, wcześniej określonego punktu startowego na obrzeżach basenu, a platforma jest również przenoszona do każdej z 4 różnych pozycji kwadrantów.
10. Faza nabywania rozpoczyna się następnego dnia i składa się z 4 prób dziennie przez 5 kolejnych dni. W tej fazie ukryta platforma pozostaje w tym samym miejscu, a zwierzęta uczą się nawigować do niej, korzystając z dystalnych wskazówek w pomieszczeniu.
11. Ponownie, dla każdej z 4 prób zwierzę jest umieszczane w basenie w innym, wcześniej określonym punkcie startowym. Każdego dnia dwa z punktów startowych znajdują się po lewej stronie, a dwa po prawej stronie platformy, w losowej kolejności, aby uniknąć wykształcenia egocentrycznych strategii przestrzennych w rozwiązywaniu zadania.
12. Maksymalny czas płynięcia w każdej próbie nabywania wynosi 60 sekund, po czym eksperymentator prowadzi zwierzę i kładzie je na platformie. Zwierzę pozostaje na platformie przez 20 sekund po ucieczce.
13. W 7. dniu, 24 h po ostatniej próbie treningowej, przeprowadza się 60-sekundową próbę sondowania, w której platforma zostaje usunięta. Faza ta określa preferencję zwierzęcia do kwadrantu, w którym wcześniej znajdowała się platforma, i służy jako pomiar przestrzennej pamięci referencyjnej¹⁰. Po próbie sondowania platforma jest przywracana do tego samego kwadrantu i przeprowadza się 3 zwykłe próby nabywania.
14. W teście uczenia się odwrócenia w 8. dniu platforma jest przenoszona w nowe miejsce w celu oceny zdolności do uczenia się odwrócenia. Pomiar czasu, jaki zwierzęta spędzają na poszukiwaniu platformy w jej poprzedniej lokalizacji w porównaniu z nową lokalizacją, pozwala ocenić perseverację, czyli niezdolność do zahamowania reakcji na poprzednią lokalizację po przeniesieniu platformy¹⁰. Podobnie jak w fazach nabywania i sondowania, przeprowadza się 4 próby trwające 60 sekund.
15. W teście z sygnałem jako miary funkcji wzrokowej i motorycznej stosuje się odpowiednio latencję znalezienia platformy oraz prędkość. Różnice między grupami eksperymentalnymi w tej fazie muszą być uwzględnione przy interpretacji wyników nabywania i pamięci, ponieważ mogą istnieć różnice w funkcjach sensoryczno-motorycznych między grupami.
16. W fazie nabywania jako miary uczenia się przestrzennego stosuje się średnią latencję znalezienia platformy i/lub długość ścieżki. U zdrowych zwierząt latencja ucieczki stopniowo maleje w ciągu pięciu dni nabywania, tak że średni czas ucieczki w 5. dniu wynosi około 15 do 20 sekund (Rys. 5A).
17. W fazie sondowania jako miary przestrzennej pamięci referencyjnej stosuje się średnią odległość od platformy (Rys. 5B) i/lub latencję do pierwszego dotarcia do poprzedniej lokalizacji platformy (Rys. 5C).
18. W fazie odwrócenia jako miary perseveracji stosuje się procent czasu spędzonego w starym kwadrancie w porównaniu z nowym kwadrantem zawierającym platformę. W ciągu czterech prób preferencja dla starej lokalizacji platformy powinna maleć, podczas gdy kształtuje się preferencja dla nowej lokalizacji platformy (Rys. 5D).

5. Reprezentatywne wyniki:

Rysunek 1. Schematyczne przedstawienie zastosowanych paradygmatów testów poznawczych.

Rycina 2. Reprezentatywne wyniki zwierząt kontrolnych w zadaniu rozpoznawania nowej lokalizacji. A) Całkowity czas spędzony na eksploracji dwóch pozycji przestrzennych powinien być w przybliżeniu równy podczas fazy zapoznawczej. B) Stosunek eksploracji (czas spędzony na eksploracji nowej pozycji / czas spędzony na eksploracji obu pozycji) wykazuje wyraźną preferencję dla nowej pozycji przestrzennej po odstępach czasu wynoszących 5 minut i 24 godziny. Linia przerywana oznacza wynik przypadkowy.

Rysunek 3. Reprezentatywne wyniki uzyskane od zwierząt kontrolnych w labiryncie krzyżowym. Zwierzęta zdrowe spędzają w ramionach otwartych mniej czasu, niż wynikałoby to z przypadku (oznaczono linią przerywaną). Zwierzęta lękowe spędzają proporcjonalnie mniej czasu w ramionach otwartych w porównaniu z grupą kontrolną, natomiast wielokrotna ekspozycja na labirynt lub podanie środków anksjolitycznych zwiększa czas spędzony w ramionach otwartych.

Rysunek 4. Reprezentatywne wyniki zwierząt kontrolnych w zadaniu warunkowania lękowego. Niskie poziomy zamarcia obserwuje się podczas pierwszej ekspozycji na komorę (baseline) oraz w sytuacji, gdy kontekst zostaje zmieniony przed testem sygnałowym (test przed sygnałem). W przeciwieństwie do tego, zdrowe zwierzęta spędzają większość okresu po treningu na zachowaniu zamarcia. Jeśli zwierzęta pamiętają kontekst, w którym odbył się trening po 24-godzinnej przerwie, będą wykazywać zachowanie zamarcia przez około 70% czasu 5-minutowej próby kontekstowej. Podobnie, jeśli zwierzęta pamiętają sygnał dźwiękowy, wykazują wysokie poziomy zamarcia podczas testu sygnałowego oraz po sygnale.

Rysunek 5. Reprezentatywne wyniki zwierząt z grupy kontrolnej w zadaniu w labiryncie wodnym Morrisa. A) Latencja ucieczki zmniejsza się wraz z postępującym treningiem podczas fazy nabywania. B) i C) Średnia odległość od oraz latencja do pierwszego przekroczenia poprzedniego miejsca platformy podczas 24-godzinnego testu sondy służą jako miary przestrzennej pamięci referencyjnej. D) Uczenie się odwrócenia jest oceniane poprzez zmianę położenia platformy w ostatnim dniu testów. W ciągu 4 prób zdrowe zwierzęta stopniowo przestają przeszukiwać stary kwadrant i uczą się, że platforma znajduje się w nowym miejscu.

Dyskusja

Istnieje pilna potrzeba opracowania długoterminowych strategii mających na celu zapobieganie rozwojowi dysfunkcji poznawczych, które stają się coraz powszechniejsze u osób po przejściach nowotworowych^12,13. Terapie komórkami macierzystymi mogą stanowić sposób łagodzenia szeregu następstw w obrębie prawidłowych tkanek OUN, ponieważ dają one możliwość zastąpienia komórek utraconych lub uszkodzonych w wyniku cytotoksycznych terapii antynowotworowych¹⁴. Aby przyspieszyć realizację tych dążeń, przeprowadziliśmy serię eksperymentów typu proof of principle, które potwierdziły zdolność wszczepionych do czaszki hNSCs do funkcjonalnej regeneracji funkcji poznawczych w obrębie napromieniowanego łoża tkankowego OUN³. Kluczowa dla tego przedsięwzięcia była możliwość rzetelnego i powtarzalnego przeprowadzenia serii ściśle kontrolowanych testów poznawczych. Szczegółowo opisaliśmy te krytyczne procedury, aby przyspieszyć potencjał translacyjny terapii komórkami macierzystymi w praktyce klinicznej. Poniżej wyróżniono dalsze kwestie, które mogą mieć istotny wpływ na jakość uzyskanych danych.

Testy poznawcze wymagają szczególnej dbałości o szczegóły, a przestrzeganie określonych standardowych praktyk może pomóc zminimalizować artefakty utrudniające interpretację wyników. Zaleca się korzystanie z wydzielonych pomieszczeń do testów behawioralnych, oddzielonych od pomieszczeń dla zwierząt i osób przeprowadzających eksperyment. Wskazane jest również stosowanie „białego szumu”, który blokuje hałasy zewnętrzne w animalarium, mogące rozpraszać zwierzęta podczas wykonywania zadania. Aby zminimalizować stres u zwierząt przeznaczonych do testów poznawczych, ważne jest, aby przed rozpoczęciem zadań zostały one oswojone z eksperymentatorami, którzy będą przeprowadzać testy behawioralne. Ogólnie, w przypadku testowania samic i samców, zaleca się testowanie najpierw samic, ponieważ wykazują one tendencję do większego lęku podczas testów, jeśli w arenach badawczych pozostają sygnały zapachowe samców. Przy przeprowadzaniu seryjnej baterii zadań istotne jest, aby najpierw poddawać zwierzęta zadaniom najmniej stresującym (takim jak EPM, NPR), a na końcu zadaniom najbardziej stresującym (takim jak FC, MWM).