Normotermiczne zatrzymanie krążenia i reanimacja krążeniowo-oddechowa: mysi model uszkodzenia reperfuzyjnego wynikającego z niedokrwienia

Podsumowanie

Przedstawiono wydajny model ostrej niewydolności nerek związanej z okresem okołoperacyjnym i opieką krytyczną. Wykorzystując hipoperfuzję całego organizmu wywołaną zatrzymaniem krążenia, możliwe jest niemal całkowite odtworzenie zmian histologicznych i funkcjonalnych charakterystycznych dla klinicznego AKI.

Streszczenie

Ostre uszkodzenie nerek (AKI) jest częstym i wysoce śmiertelnym powikłaniem stanów krytycznych, charakteryzującym się wysoką śmiertelnością^1-4 i najczęściej wywołanym przez hipoperfuzję całego organizmu.^5,6 Skuteczne odwzorowanie hipoperfuzji całego organizmu w modelach gryzoni wiązało się z licznymi trudnościami.^7-9,9,10 Modele wykorzystujące niedokrwienie ogniskowe wielokrotnie dawały wyniki, które nie przekładały się na warunki kliniczne, natomiast większe modele zwierzęce, umożliwiające hipoperfuzję całego organizmu, nie zapewniają dostępu do pełnego zestawu narzędzi manipulacji genetycznych możliwych do zastosowania u myszy.^11,12 Jednak w ostatnich latach opracowano model zatrzymania krążenia i resuscytacji krążeniowo-oddechowej u myszy, który może zostać dostosowany do modelowania AKI.¹³ Model ten wiarygodnie odwzorowuje fizjologiczne, funkcjonalne, anatomiczne i histologiczne następstwa obserwowane w klinicznym AKI, jest szybko powtarzalny i oferuje wszystkie istotne zalety mysiego modelu chirurgicznego, w tym dostęp do technik manipulacji genetycznych, niski koszt w porównaniu do dużych zwierząt oraz łatwość zastosowania. Nasz zespół zdobył szerokie doświadczenie w wykorzystaniu tego modelu do oceny szeregu narządowych następstw AKI.^14,15

Protokół

Wszystkie opisane procedury zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi National Institutes of Health dotyczącymi opieki i wykorzystania zwierząt w badaniach, a wszystkie protokoły dotyczące zwierząt zostały zatwierdzone przez Institutional Animal Care and Use Committee Uniwersytetu Oregon Health & Science University.

1. Przygotowanie chirurgiczne

1. Zważ mysz. Opisana procedura jest wykonywana na myszach C57BL/6 o wadze od 20 do 25 g. Znieczulenie wprowadza się w komorze indukcyjnej przy użyciu 3-4% izofluranu, a następnie utrzymuje przy użyciu 1,5-2,5% izofluranu w mieszaninie powietrza i tlenu.
2. Nasmaruj oczy i ułóż zwierzę na plecach na macie grzewczej. Unieruchom 4 kończyny za pomocą taśmy. Tylne łapy można przymocować w pozycji neutralnej, jednak przednie łapy należy zabezpieczyć jak najbliżej klatki piersiowej, aby umożliwić pełną ruchomość ścian klatki piersiowej podczas ucisków.
3. Nasmaruj i wprowadź rektalną sondę temperatury. Temperaturę kontroluje się za pomocą maty grzewczej i lampy podłączonych do elektronicznego regulatora temperatury (Digi-Sense, Cole Parmer, Vernon Hills IL), ustawionego na utrzymanie 37,0°C. Ponieważ w stanie braku przepływu (no-flow) może wytworzyć się gradient temperatury wewnątrz organizmu zwierzęcia, ważne jest, aby temperaturę mierzyć i kontrolować w pobliżu badanego organu.
4. Wykonaj intubację tchawicy, używając 2,5 cm cewnika teflonowego 2 ga (Insyte-W, BD, Franklin NJ) oraz odciętego dystalnego końca kątowego wprowadzacza (Frova Introducer, Cook Medical, Bloomington IN). Dopuszczalne są inne metody intubacji tchawicy, jednak zastosowanie kątowego wprowadzacza pozwala na prawidłowe ustawienie szyi w lekkim wyproście, co optymalizuje dostęp chirurgiczny do umieszczenia cewnika dożylnego. Piastę cewnika endotrachealnego mocuje się pętlą nici chirurgicznej do siekacza i utrzymuje pod lekkim napięciem, aby unieruchomić głowę podczas ucisków klatki piersiowej.
5. Wentyluj mechanicznie mysz za pomocą respiratora dla gryzoni ustawionego na 140 μL, 150 oddechów/minutę. Wartość ta nie jest dostosowywana do wagi, ponieważ protokół ten jest zawsze wykonywany na zwierzętach o wadze 20-25 g. Nie doprowadzaj do zbyt głębokiego znieczulenia. Nie ustawiaj respiratora na stosowanie dodatniego ciśnienia końcowowydechowego (PEEP), ponieważ upośledza to reanimację.
6. Stosując technikę sterylną i mikroskop operacyjny, wprowadź uprzednio przepłukany cewnik PE-10 do żyły szyjnej. Można użyć dowolnej strony, jednak zastosowanie strony najbliższej operatorowi zmniejsza ryzyko wysunięcia cewnika podczas ucisków klatki piersiowej lub innych manipulacji. W brzegi rany infiltruje się 0,1 mL 0,5% bupiwakainy w celu opanowania bólu pooperacyjnego.
7. Zabeziecz cewnik PE-10 w zamknięciu skóry za pomocą chirurgicznego kleju cyjanoakrylowego.
8. Umieść podskórne elektrody EKG i podłącz je do urządzenia monitorującego. Szczególna uwaga poświęcona ścieżce sygnału oraz maksymalizacja samego sygnału są kluczowe dla powodzenia reanimacji. Upewnij się, że wszystkie przewody są przymocowane do powierzchni operacyjnej, zminimalizuj krzyżowanie się sygnałów oraz ogranicz liczbę izolatorów (takich jak powietrze w pustych igłach lub sploty drutów) w ścieżce sygnału. Pełne igły połączone z nieplecionym przewodem mogą zostać zakupione lub wykonane w laboratorium. Po podłączeniu zoptymalizuj sygnał EKG na monitorze.

2. Zatrzymanie krążenia

1. Należy upewnić się, że mysz jest normotermiczna, co definiuje się jako temperatura rektalna 36.5°C - 37.5°CPodać 40 μL chlorku potasu o stężeniu 0,5 M w temperaturze pokojowej dożylnie i obserwować linię izoelektryczną w EKG. Korekta dawki w zależności od masy ciała nie jest konieczna w zakresie 20–25 g. Uruchomić stoper czasu zatrzymania krążenia.
2. Odłącz respirator. Przerwij podawanie par anestetyków. Wyłącz podgrzewacz oraz wszelkie inne urządzenia generujące szumy elektroniczne, które mogą zakłócać monitorowanie EKG. Przykryj mysz kocem izolacyjnym.
3. Rejestruj temperaturę w każdej minucie podczas zatrzymania krążenia. W razie potrzeby można użyć lampy grzewczej, aby podnieść temperaturę głęboką do zakresu normotermii. Podczas zatrzymania krążenia przygotuj materiały i sprzęt (np. strzykawkę z epinefryną) do resuscytacji. Pomocna może okazać się lista kontrolna, aby zapewnić nieprzerwaną resuscytację, co jest niezbędne dla przeżycia.
4. Po 7 minutach i 30 sekundach zatrzymania krążenia ponownie podłącz respirator i zwiększ częstotliwość oddechów do 180 oddechów/min, utrzymując objętość oddechową na poziomie ustawionym przed zatrzymaniem krążenia.
5. W 8. minucie należy rozpocząć uciśnięcia klatki piersiowej w tempie 30 uderzeń na minutę. Do oceny częstotliwości RKO można wykorzystać artefakty ruchowe w zapisie EKG. Uciśnięcia klatki piersiowej należy wykonywać palcem wskazującym, 5 mm powyżej wyrostka xifoideum i lekko na lewo od linii środkowej. Klatka piersiowa powinna być uciskana na 1/3–1/2 odległości przednio-tylnej, a pomiędzy uciśnięciami musi nastąpić pełny powrót klatki do pozycji wyjściowej. Położenie palca oraz optymalna siła ucisku są kwestiami absolutnie krytycznymi. Brak przeżycia w tym modelu niemal zawsze wynika z nieoptymalnego wykonania RKO.
6. Wprowadź w infuzji 0,5 ml epinefryny, rozcieńczonej do 15 μg/mL, w ciągu pierwszych 30 sekund RKO. Całkowita dawka epinefryny wynosi 8-12 μgUważnie obserwuj zapis EKG pod kątem powrotu spontanicznego krążenia (ROSC). Pomiędzy artefaktami wynikającymi z uciśnięć klatki piersiowej widoczne są zespoły QRS o wąskim kształcie. ROSC następuje zazwyczaj między 90 sekundami a 2 minutami od rozpoczęcia resuscytacji krążeniowo-oddechowej (CPR). Resuscytację przerywa się, jeśli ROSC nie nastąpi w ciągu 3 minut. W ciągu pierwszych 2 minut po ROSC obserwuje się częste dodatkowe skurcze komór oraz zmiany osi elektrycznej serca w EKG, które prawie zawsze ustępują, przechodząc w stabilną tachykardię zatokową w 2. minucie.
7. Zarejestrować całkowity czas reanimacji oraz dawkę epinefryny. Rejestrować temperaturę w każdej minucie przez 10 minut po przywróceniu spontanicznego krążenia (ROSC).
8. Elektrody EKG można usunąć w momencie rozpoczęcia spontanicznego oddychania, zazwyczaj w ciągu 12–15 minut po ROSC.
9. Ekstubuj tchawicę, gdy częstotliwość oddechów spontanicznych wynosi >60/min.
10. Umieść mysz w klatce regeneracyjnej na powierzchni z kontrolowaną temperaturą ustawioną na 37°C przez pierwsze 2 godziny po zabiegu, zapewniając łatwy dostęp do pokarmu i wody. Następnie klatkę można przenieść do standardowych warunków bytowych pooperacyjnych, gdy mysz całkowicie wybudzi się z anestezji i stanie się aktywna.

3. Wykrwawienie/perfuzja utrwalająca i pobranie nerek

1. 24h po CA/CPR wprowadź znieczulenie izofluranem w stężeniu 3-4% i unieruchom zwierzę w pozycji na plecach na powierzchni operacyjnej wewnątrz dygestorium przystosowanego do pracy z formaliną.
2. Pogłęb znieczulenie, stopniowo zwiększając stężenie par anestetyku do 5%, i upewnij się, że mysz jest głęboko znieczulona, co potwierdza ustanie spontanicznego oddychania.
3. Wykonaj torakotomię metodą „clamshell” i przeprowadź upuścivienie krwi u myszy poprzez nakłucie wierzchołka lewej komory serca zgodnie ze standardowymi technikami.
4. Za pomocą tej samej igły podaj 0,9% roztwór soli fizjologicznej poprzez powolną infuzję. Aby przyspieszyć perfuzję/upuścivienie krwi, nacinij nożyczkami przedsionek prawy. Wykonaj laparotomię i obserwuj nerki. Gdy staną się białe, można zamienić sól fizjologiczną na 4% formalinę w celu utrwalenia. Następnie nerki zostają zatopione w parafinie i zabarwione Fluoro-jade B w celu ilościowej oceny nekrozy nabłonka kanalikowego.

4. Reprezentatywne wyniki:

Po wywołaniu CA średnie ciśnienie tętnicze (MAP) oraz regionalny przepływ krwi nerkowej (RRBCF) spadają niemal do zera i pozostają na tym poziomie aż do rozpoczęcia reanimacji (Rysunek 1). 24h po CA/CPR surowicze wskaźniki funkcji nerek (azot mocznika we krwi, BUN oraz kreatynina) są znacznie podwyższone w porównaniu z grupą zwierząt poddanych operacji pozorowanej. Poziomy AST/ALT są również podwyższone, co świadczy o głębokim niedokrwieniu całego organizmu (Rysunek 2). Lipokalina związana z żelatynazą neutrofilową (NGAL), będąca czułym wskaźnikiem niedokrwiennego uszkodzenia nerek, wykazuje masową nadekspresję 24h po CA/CPR (Rysunek 3). Wreszcie, mikrofotografie wykazują ogniskową martwicę rdzenia charakterystyczną dla niedokrwiennego uszkodzenia nerek, z cieńczeniem nabłonka kanalikowego i wypełnieniem światła w barwieniu hematoksyliną i eozyną (Rysunek 4, panel a) oraz rozległą śmiercią komórek w nabłonku kanalików rdzeniowych po barwieniu fluoro-jade B (Rysunek 4, panel b).

Rycina 1. Zatrzymanie krążenia powoduje natychmiastową utratę ciśnienia perfuzyjnego, reprezentowanego tutaj jako średnie ciśnienie tętnicze (MAP) mierzone w tętnicy udowej, co skutkuje niemal całkowitym ustaniem regionalnego przepływu krwi w korze nerek (RRCBF) przez cały okres zatrzymania krążenia (obszar zacieniony). Resuscytacja za pomocą uciśnięć klatki piersiowej i podania epinefryny przywraca MAP do poziomu prawidłowego, a RRCBF stopniowo wzrasta w okresie po resuscytacji. Powielono za zgodą¹⁴.

Rysunek 2. 24 godziny po zabiegu stężenie azotu mocznika we krwi (BUN), kreatyniny w surowicy oraz stopień śmierci komórek cewkowych są znacznie wyższe u zwierząt poddanych CA/CPR w porównaniu ze zwierzętami, u których przeprowadzono procedurę pozorowaną (sham). CA/CPR indukuje ogólnoustrojowe uszkodzenie niedokrwienne, co w tym przypadku objawia się masywnym wzrostem aktywności enzymów wątrobowych – aminotransferazy alaninowej (ALT) i aminotransferazy asparaginianowej (AST) – u myszy po CA/CPR w porównaniu ze zwierzętami z grupy pozorowanej.

Rysunek 3. Western blot wykonany z użyciem przeciwciała poliklonalnego przeciwko lipokalinie związanej z żelatynazą neutrofili (NGAL), która jest czułym wskaźnikiem niedokrwiennego uszkodzenia nerek. Próbki moczu pobrano bezpośrednio przed („pre”) oraz 24 godziny po („24h”) zatrzymaniu krążenia i resuscytacji krążeniowo-oddechowej (CA/CPR) u 4 zwierząt (oznaczonych powyżej jako a, b, c i d). Po CA/CPR w moczu myszy następuje masna nadekspresja NGAL. Przedruk za zgodą¹⁴.

Rysunek 4. A) Barwienie hematoksyliną i eozyną przekroju w osi krótkiej tkanki nerkowej w obrębie zatoki 24 h po CA/CPR. Widoczne są ogniskowe, lecz wyraźne uszkodzenia cewek rdzeniowych i korowo-rdzeniowych z obecnością zatorów cewkowych. Strzałki wskazują uszkodzone cewki z obrzękniętymi, pyknotycznymi jądrami na przejściu korowo-rdzeniowym. B) Barwienie Fluoro-Jade B tego samego obszaru u tego samego zwierzęcia 24 h po CA/CPR. Fluoro-Jade B barwi komórki nekrotyczne na jasnozielono, wykazując ogniskową martwicę cewkową w obszarze korowo-rdzeniowym. Strzałki wskazują intensywnie zabarwione, uszkodzone cewki na przejściu korowo-rdzeniowym. Wyniki te są w znacznym stopniu zbliżone do obrazu biopsji nerek u ludzi rozwijających AKI i różnią się od wyników uzyskiwanych w innych zwierzęcych modelach AKI.

Dyskusja

Normotermiczny model zatrzymania krążenia i reanimacji krążeniowo-oddechowej u myszy oferuje wiele możliwości oceny w modelu odzwierciedlającym patofizjologię i morfologię najczęstszej klinicznej przyczyny AKI, jaką jest hipoperfuzja całego organizmu. Weryfikacja hipotez może być wspomagana dzięki dostępowi do szerokiego wachlarza technik manipulacji genetycznych oraz dobrze poznanej i scharakteryzowanej anatomii i fizjologii myszy laboratoryjnej.

Jak tutaj opisano, przeżywalność w rękach dośw...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Chlorek potasu	Abbott Laboratories	06653-5
Izofluran	Abbott Laboratories	05260-05 (i inne)
Epinefryna HCl	Różni dostawcy	Wiele
Sterownik temperatury Digi-Sense	Cole-Parmer	EW-89000-00
Kaniula dożylna Angiocath IV	VWR international	381134
Kątowy wprowadzacz drożności dróg oddechowych Frova	Cook	G27282
Respirator dla myszy MicroVent	Harvard Apparatus	733591