Barwienie immunologiczne tkanek do obrazowania cytometrii masowej

Streszczenie

Film opisuje przygotowanie próbki tkanki do obrazowania cytometrii masowej. Tkanka jest najpierw przetwarzana w celu zdemaskowania epitopów antygenu, przepuszczalności komórek i zablokowania niespecyficznych miejsc wiązania przeciwciał. Następnie tkanka jest inkubowana z koktajlem przeciwciał sprzężonych z metalem i barwieniem jądrowym. Na koniec próbka tkanki poddanej działaniu środka jest obrazowana za pomocą skanera optycznego.

Protokół

1. Wstępne leczenie tkanek:

Dla świeżo mrożonych tkanek:

1. Umieść szklany słoik Coplin w zamrażarce w temperaturze -20°C na co najmniej godzinę przed użyciem.
2. Wyjmij szkiełka z zamrażarki w temperaturze -80°C i umieść je w szklanym słoiku Coplin w zamrażarce w temperaturze -20°C na co najmniej 15 minut.
3. Pod wyciągiem użyj obcinacza do ampułek, aby otworzyć szklaną ampułkę z 16% paraformaldehydu (PFA). Wyrzuć potłuczone szkło w odpowiedni sposób.
4. Dodaj 10 ml 16% PFA i 30 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanami (PBS) do plastikowego słoika Coplin. Upewnij się, że PBS jest wstępnie schłodzony do 4°C.
5. Przenieś ten roztwór do lodówki o temperaturze 4°C na co najmniej 15 minut.
6. Po 15 minutach przenieś szklany słoik Coplin ze szkiełkami do lodówki w temperaturze 4°C na 10 minut.
7. Przenieś szkiełka ze szklanego słoika do plastikowego słoika Coplin zawierającego zimny 4% roztwór PFA.
8. Przymocuj szkiełka z 4% PFA przez 30 minut w lodówce.
9. Opłucz szkiełka trzykrotnie w temperaturze pokojowej PBS przez 5 minut każde, zapewniając dokładne płukanie między cyklami.

Dla tkanek FFPE:

1. Zacznij od skrawków tkanek 5 μm utrwalonych w formalinie (FFPE) zamontowanych na dodatnio naładowanych standardowych szkiełkach mikroskopowych.
2. Odwoskować szkiełka, podgrzewając je w temperaturze 60°C przez godzinę.
3. Wyjmij szkiełka i schłodzić je do temperatury pokojowej przez około 5 minut.
4. Umieść szkiełka w skrzynce do slajdów i płucz je dwukrotnie w kąpieli ksylenowej przez 3 minuty.
5. Ponownie przepłucz szkiełka 100% etanolem przez 1 minutę, dwukrotnie.
6. Podobnie płucz szkiełka w 95% i 70% etanolu przez 1 minutę każde.
7. Na koniec dwukrotnie spłukać końcowo w wodzie destylowanej przez 3 minuty.
   nuta: Hyperion nie może wykonać ablacji w promieniu 2 mm od krawędzi szkiełka, wyśrodkować tkankę tak bardzo, jak to możliwe.

2. Pobieranie epitopów pod wpływem ciepła (HIER)

1. Przygotować bufor pH9 kwasu tris-etylenodiaminotetraoctowego (EDTA):
   1. Abcam ab93684 Tris-EDTA pH9 HIER Buffer jest kupowany 100x i rozcieńczany do 1x w wodzie do wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC).
   2. Np.: 2,5 ml Abcam ab93684 do 247,5 ml wody HPLC.
      nuta: Nie należy stosować starszych niż sześć miesięcy.
2. Ustaw komorę maskującą do podgrzewania zjeżdżalni. Najpierw napełnij dno komory 500 ml wody z kranu. Następnie dodaj 250 ml wody z kranu do obu bocznych pojemników i 200 ml wody z kranu do centralnego pojemnika.
3. Umieść do 3 slajdów w koperze na 5 miejsc.
4. Napełnij szkiełko buforem HIER, aż tkanka zostanie całkowicie zanurzona. nuta: Upewnij się, że koperta ślizgowa ma mały otwór w górze, aby odprowadzać parę i zapobiegać wzrostowi ciśnienia.
5. Uruchomić "Program 4" na 20 minut w temperaturze 95 °C.
6. W międzyczasie podgrzej wstępnie komory inkubacyjne do kolejnych kroków (patrz krok 3.5)
7. Po inkubacji wyjmij kopertę i umieść ją w wannie z zimną wodą z kranu.
8. Pozostaw do ostygnięcia na 5 minut.
9. Usuń połowę bufora z koperty i zastąp go wodą destylowaną. Pozostaw do ostygnięcia na 5 minut.
10. Stopniowo usuwaj bufor i dwukrotnie zwiększaj objętość wody, za każdym razem z 5-minutowym okresem chłodzenia.
11. Na koniec opłucz szkiełka w 100% wodzie destylowanej.

3. Blokowanie niespecyficznego powiązania

1. Przygotuj bufor blokujący (sól fizjologiczna buforowana trisem lub TBS, 0,1% Triton X-100, 3% albumina surowicy bydlęcej lub BSA), dodając 150 μl TBS z 10% BSA do 350 μl TBS z 0,1% Triton X-10.
   nuta: TBS z 10% BSA jest przechowywany w temperaturze -20 °C i powinien być za każdym razem rozmrożony na świeżo.
2. Za pomocą koperty do slajdów lub słoików Coplin myj szkiełka przez 5 minut w TBS, 0,1% Triton X-100 dwukrotnie.
3. Wyjmij slajd z koperty i użyj chusteczki Kim, aby usunąć bufor spoza okręgu PAP. Odczekaj ~1 minutę do lekkiego wyschnięcia.
4. Za pomocą P200 dodaj kilka kropli buforu blokującego na tkankę, tylko tyle, aby ją przykryć. Linia PAP powinna utrzymywać płyn nad tkanką.
   nuta: Jeśli bufor nie jest zamknięty w kręgu PAP, ponownie narysuj krąg PAP wokół tkanki, aby zapobiec późniejszej utracie przeciwciał.
5. Inkubować szkiełko w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej przez 1 godzinę.
   nuta: Puste pudełko na końcówki do pipet dobrze sprawdza się w komorze wilgotnościowej. Upewnij się, że na dnie znajduje się niewielka ilość wody z kranu.

4. Barwienie przeciwciałami sprzężonymi z metalami

1. Usunąć przeciwciała sprzężone z metalem z 4°C i odwirować przy 10 000 x G przez 1 minutę.
2. Przygotowanie optymalnego rozcieńczenia głównej mieszaniny przeciwciał w TBS, 0,1% Triton X-100 i 1% mieszaninie BSA.
   UWAGA: a) Optymalne rozcieńczenie każdego przeciwciała musi być określone doświadczalnie i jest jednym z najbardziej krytycznych etapów udanych eksperymentów z obrazową cytometrią masową. Użyj arkusza kalkulacyjnego Excel, aby obliczyć objętości. Zrób tylko trochę więcej niż jest to wymagane ze względu na koszt przeciwciał. np. Jeśli zajęło to 200 μl buforu blokującego, przygotuj 250 μl mieszanki głównej. b) Mieszanka wzorcowa powinna być przygotowana na świeżo dla każdego eksperymentu na etapie blokowania.
3. Po inkubacji (patrz krok 3.5) wyjąć szkiełko z inkubatora.
4. Usuń nadmiar bufora blokującego, dotykając slajdu w pionie i poziomie w chusteczki Kim. Powinno to pozostawić pewien bufor blokujący na tkance, ale usunie większość z niego.
5. Odczekaj ~1 minutę do lekkiego wyschnięcia.
6. Umieść szkiełko w komorze wilgotnościowej o temperaturze 4°C i pozwól mu się zrównoważyć.
7. Następnie ostrożnie odpipetować główną mieszaninę przeciwciał na tkankę, bardzo uważając, aby roztwór znajdował się w okręgu PAP.
8. Zamknąć komorę wilgotnościową i inkubować przez noc w temperaturze 4°C.
9. Po całonocnej inkubacji wyjmij szkiełko z 4°C i usuń nadmiar mieszanki wzorcowej, stukając szkiełkiem pionowo i poziomo w chusteczki Kim.
10. Umieść szkiełko w kopertówce lub słoiku Coplin; myj przez 5 minut roztworem soli fizjologicznej buforowanym fosforanami lub PBS, uzupełnionym 0,2% Triton X-100, dwukrotnie.
11. Następnie umyj szkiełko w PBS przez 5 minut, dwukrotnie. Wyjmij szkiełko i pozostaw do wyschnięcia na około 1 minutę.

5. Interkalacja DNA

1. W przypadku interkalacji DNA rozcieńczyć Intercalator-Ir w stosunku 1:1000 w PBS.
2. Ostrożnie odpipetować rozcieńczony interkalator na tkankę, zwracając szczególną uwagę na to, aby roztwór znajdował się w okręgu PAP.
3. Inkubować przez 30 minut w temperaturze pokojowej w komorze wilgotnościowej używanej do blokowania.
4. Następnie dotknij slajdów pionowo i poziomo na chusteczkach Kim, aby usunąć nadmiar barwnika Intercalator-Ir.
5. Umieść szkiełko w kopertówce lub słoiku Coplin i umyj dwukrotnie wodą HPLC przez 5 minut każdy.
6. Wysuszyć szkiełka w eksykatorze przez 5 minut przed skanowaniem.

6. Skanowanie obrazów

1. Do skanowania szkiełek użyj wytrawiacza do szkła z węglika spiekanego, aby zarysować cztery słabe X w szkiełku. Precyzyjne punkty nauczania pozwolą na najlepszą rejestrację obrazu.
   nuta: Nie zbliżaj się zbytnio do krawędzi.
2. Skanowanie za pomocą płaskiego skanera dokumentów z prędkością nie mniejszą niż 1200 punktów na cal
3. Przytnij ten obraz jak najbliżej obramowania slajdu i zapisz go na dysku flash.
4. Aby uzyskać wspólną rejestrację obrazu, zeskanuj slajd na Hamamatsu NanoZoomer z "Pre_IMC" w nazwie pliku.

Wyniki

Rysunek 1: Schematyczne przedstawienie procedury barwienia immunologicznego tkanek w obrazowej cytometrii masowej

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Technika magazynowania
Słoiki z kopinem
Plastikowa koperta 5-prowadnicowa z otworem wentylacyjnym
Urządzenie do pobierania antygenu (komora demontowizująca)
skaner
Chemikalia i enzymy:
ksylen
200-procentowy etanol
Woda HPLC
Abcam ab93684 Bufor HIER Tris-EDTA pH9
Tbs
TBS z 0,1% Trition X-100
TBS z 10% BSA
Pbs
PBS z 0,2% Trition X-100