$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Przygotowanie plastra
- Zbuduj lub zdobądź komorę do odzysku plastrów.
UWAGA: Zasada działania komory odzysku jest prosta i można ją wykonać w laboratorium (rysunek 1). Krótko mówiąc, komora jest pojemnikiem, w którym wkładany jest kosz, aby utrzymać plastry mózgu na poziomie niższym niż powierzchnia sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (aCSF).
- Jako przykład uzyskaj cztery pierścienie (o wysokości 4 - 6 mm) (Rysunek 1A, widok z boku; B, widok z góry), przecinając strzykawkę o pojemności 30 cm3. Następnie przyklej rozciągnięte siatki (np. wycięte z nylonowego węża) po jednej stronie pierścieni, aby przytrzymać plasterki mózgu (ryc. 1B) i sklej pierścienie ze sobą.
UWAGA: Można użyć pistoletu do klejenia.
- Po sklejeniu czterech pierścieni przyklej zakrzywioną plastikową ściankę w kształcie trapezu równoramiennego do dwóch pierścieni (ryc. 1A i B), aby odprowadzić pęcherzyki tlenu z regenerujących się wycinków mózgu (ryc. 1C i D). Jak pokazano na rysunku 1D, umieść system dyfuzji tlenu (w tym przypadku rurkę dyspersji gazu) po tej samej stronie, co plastikowe ścianki.
- Przed krojeniem należy natlenić (95%O2/5% CO2) i schłodzić roztwór do krojenia (patrz krok 1.4) do temperatury 0 - 2 °C.
- Napełnij niestandardową komorę rekuperacyjną standardowym aCSF w temperaturze pokojowej (RT). Upewnij się, że aCSF jest dobrze natleniony (20 - 30 minut, czas może się różnić w zależności od objętości komory) przed umieszczeniem plastrów w komorze odzyskiwania. Upewnij się, że pęcherzyki gazu nie stykają się bezpośrednio z plastrami ani ich nie zakłócają.
- Wyłóż tackę na lód wibratomu lodem i napełnij ją zimną wodą, tak aby jedna trzecia do połowy komory krojenia była zanurzona. Ostrożnie umieść system dostarczania tlenu (np. kamień dyfuzyjny gazu) i sondę temperatury w komorze krojenia, aby żaden przedmiot nie przeszkadzał w ruchu ostrza lub manipulacji plastrami.
- Przygotuj obszar sekcji i narzędzia niezbędne do ekstrakcji mózgu i wypreparowania pożądanego obszaru mózgu.
UWAGA: Dokładna przeprowadzona sekcja będzie zależeć od konkretnego badanego obszaru mózgu, ponieważ różne struktury mózgu będą wymagały krojenia w różnych płaszczyznach (np. Plasterki czołowe, strzałkowe lub poziome).
- Umieść następujące narzędzia na podkładzie: nożyczki do dekapitacji, skalpel, małe proste nożyczki z ostrą końcówką, kleszcze do kaniulacji naczyń (lub dowolne narzędzie chirurgiczne z szeroką końcówką, takie jak rongeurs, które jest bardziej odpowiednie dla czaszek szczurów), zakrzywione kleszcze hemostatyczne, pęseta, szpatułka, szpatułka do nabierania, bibuła filtracyjna, szalka Petriego, żyletka z pojedynczą krawędzią i klej cyjanoakrylowy.
- Gdy temperatura osiągnie 0-2°C, przenieś roztwór do krojenia do komory krojenia (tacki buforowej).
- Znieczulić mysz w komorze osuszającej za pomocą izofluranu. Dokładna ilość może się różnić w zależności od wielkości użytej komory, ale w przypadku małej klatki na buty użyj kilku kropli (~3-4). Pozostaw mysz w klatce, dopóki nie stanie się nieruchoma (nie reaguje na bodźce dotykowe; około 15 sekund w opisanych tutaj warunkach). Wykonaj testy szczypania ogona i stopy, aby upewnić się, że zwierzę jest głęboko znieczulone, a następnie odetnij głowę, zanim serce przestanie bić (zwiększa żywotność komórek).
UWAGA: Po odpowiednim uzasadnieniu, niektóre laboratoria uzyskują zezwolenie na wykonanie żywej dekapitacji w celu zminimalizowania w jak największym stopniu procesów ekscytotoksycznych i zwiększenia żywotności komórek.
- Wykonaj sekcję.
UWAGA: Mózg musi zostać usunięty szybko (<45 sek.).
- Za pomocą skalpela przetnij powierzchowną skórę na szczycie czaszki od rostralnej do ogonowej.
- Obierz skórę głowy z każdej strony głowy.
- Za pomocą małych prostych nożyczek z ostrą końcówką przetnij płytkę międzyciemieniową wzdłuż szwu lambdoidalnego, aby usunąć móżdżek. Usuń kość potyliczną.
- Za pomocą tych samych nożyczek przetnij szew strzałkowy.
- Wsuń kleszcze do kaniulacji naczyń (lub rongeurs, jeśli łamie czaszkę szczura) poniżej każdej kości ciemieniowej i pociągnij, aby odsłonić mózg.
- Za pomocą zakrzywionych kleszczy hemostatycznych uszczypnij kości czołowe, aby je złamać, a następnie użyj pęsety lub kleszczy do kaniulacji naczyń, aby usunąć złamane kości. Wytnij i usuń oponę twardą tak delikatnie, jak to możliwe, ponieważ może to przeszkadzać w rozwarstwieniu.
- Wsuń szpatułkę pod mózg i delikatnie wyciągnij ją z czaszki. Umieść go w komorze krojenia (taca buforowa) uprzednio wypełnionej lodowatym CSF. Pozwól mózgowi ostygnąć przez 1-2 minuty.
- Przygotuj platformę preparacyjną, wypełniając szalkę Petriego lodem i odrobiną lodowatej wody, aby umożliwić większy kontakt powierzchniowy. Przykryj naczynie pokrywką i połóż bibułę filtracyjną na wierzchu. Zwilż bibułę filtracyjną zimnym aCSF.
- Gdy mózg ostygnie, umieść go na wypełnionej lodem szalce Petriego i szybko wykonaj odpowiednią sekcję, aby uzyskać pożądaną płaszczyznę krojenia.
- Aby uzyskać strzałkowe plastry zawierające jądro półleżące (NAc), użyj jednoostrzowej żyletki, aby przeciąć i usunąć guzki węchowe i móżdżek, jeśli są nadal obecne. Następnie wykonaj cięcie strzałkowe o szerokości 2-3 mm od bocznej granicy prawej półkuli, aby uzyskać płaską powierzchnię, która zostanie przyklejona do płytki przytrzymującej próbkę (patrz krok 1.8.11).
UWAGA: Odcięcie tylko 2 - 3 mm od bocznej granicy półkuli pozwoli na zebranie plastrów zawierających NAc z obu półkul. Właściwa sekcja będzie zależeć od badanego obszaru mózgu. W tym przypadku przeprowadza się sekcję, aby neurony NAc można było zarejestrować w strzałkowych wycinkach mózgu.
- Szybko przyklej (za pomocą kleju cyjanoakrylowego nałożonego na płytkę przytrzymującą próbkę) płaską powierzchnię cięcia mózgu do płytki zgodnie z pożądaną płaszczyzną krojenia. Aby uzyskać strzałkowe wycinki mózgu, patrz krok 1.8.10.
- Natychmiast umieść i zabezpiecz płytkę przytrzymującą próbkę w komorze krojenia, tak aby mózg był krojony doogonowo (ze względów bezpieczeństwa uchwyt ostrza należy ustawić tylko wtedy, gdy płytka próbki jest zabezpieczona).
- Ustaw wibratom z odpowiednimi parametrami krojenia (parametry używane w laboratorium dla wibratomu wymienionego w materiałach: prędkość 3 - 4, wibracje 9-10 i grubość plastra 250 μm).
- Po krojeniu należy użyć pipety transferowej z tworzywa sztucznego, aby przenieść wycinki mózgu do komory regeneracyjnej (w temperaturze pokojowej) (patrz krok 1.3). Czas rekonwalescencji może się różnić w zależności od typu neuronu, który jest badany (zwykle 30 - 90 min).
2. Nagrywanie mikropipet i przygotowanie statywu
- Zapoznaj się ze szczegółowymi wytycznymi zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza, aby uzyskać pożądane właściwości mikropipety.
UWAGA: W przypadku MSN używamy zakresu rezystancji pipet 3,2-4,0 MΩ.
- Natlenić aCSF i dostosować przepływ do 2 ml/min. Podkurzyć aCSF za pomocą pompy perystaltycznej lub przewodów próżniowych zainstalowanych w obiekcie.
- Włączyć regulator grzałki perfuzyjnej i dostosować ustawienia temperatury, aby uzyskać żądaną temperaturę (np. 31.8-32.2 °C).
UWAGA: Stabilność temperatury zależy od stałego poziomu aCSF i stałej prędkości przepływu w komorze. Ponieważ kilka właściwości biofizycznych neuronów (np. opór wejściowy, Ri, zwany również rezystancją błony, Rm) jest wrażliwych na temperaturę, ważne jest utrzymanie stabilnej temperatury.
- Włącz sterowany komputerowo wzmacniacz, kamerę, mikromanipulator i światło tła mikroskopu. Jeśli wykonujesz eksperyment, który wymaga elektrycznej stymulacji tkanki, włącz kontroler bodźca i jednostkę izolacyjną.
UWAGA: Niektóre amplifiery innych producentów zalecają "rozgrzewkę" przed użyciem, dlatego zaleca się zapoznanie się z instrukcją w celu uzyskania dokładnej procedury obsługi.
- Uruchom oprogramowanie do przechwytywania kamery, akwizycji sygnału i wzmacniacza.
- Rozmieszczenie plasterków i wizualizacja:
- Za pomocą plastikowej pipety transferowej z przyciętą końcówką delikatnie pobrać jeden wycinek mózgu z komory regeneracyjnej.
- Umieścić pipetę transferową w komorze rejestracyjnej i delikatnie wycisnąć plasterek z pipety na szkiełko nakrywkowe wyściełające dno komory.
UWAGA: Dopóki nie dochodzi do przelania, nieszkodliwe jest rozlanie się części płynu CSF z komory rekuperacyjnej do kąpieli.
- Użyj kleszczy, aby zmienić położenie plasterka, tak aby żądany obszar został umieszczony dokładnie na środku komory nagrywającej. Użyj soczewki obiektywu mikroskopu o małej mocy (4X) i okularu, aby uzyskać pomoc w ustawieniu.
- Po osiągnięciu żądanej pozycji zabezpiecz pozycję wycinka mózgu za pomocą przycisku dociskowego (znanego również jako "harfa") w komorze.
- Przełącz się na soczewkę obiektywu o dużej mocy (40X) i delikatnie ją opuść, aż dojdzie do kontaktu z CSF w komorze.
- Użyj pokrętła precyzyjnej regulacji, aby ustawić ostrość tkanki. W kontakcie z aCSF nie należy używać zgrubnego pokrętła regulacyjnego na mikroskopie, ponieważ nadmierne opuszczenie soczewki obiektywu może zmiażdżyć plasterek lub nawet złamać szkiełko nakrywkowe wyściełające dno komory, co może spowodować rozlanie się CSF na kondensator i jego uszkodzenie.
- Gdy fokus znajduje się na poziomie tkanki, obserwuj komórki w docelowym regionie pod kątem kształtu. Martwe komórki można łatwo zidentyfikować po ich spuchniętej błonie plazmatycznej i jądrze (ryc. 1E). Zdrowe komórki powinny wyglądać jak okrągłe, jajowate lub eliptyczne jednorodne struktury (ryc. 1E).
- Poszukaj komórki docelowej. Zaznacz go na ekranie komputera, aby ułatwić prowadzenie mikropipety rejestrującej. Jeśli używasz oprogramowania, takiego jak QCapture, narysuj kwadrat wokół komórki docelowej, przytrzymując lewy przycisk myszy.
- Podnieś soczewkę obiektywu tak, aby w stożku utworzonym przez soczewkę obiektywu stykającą się z płynem CSF było wystarczająco dużo miejsca, aby umieścić i przesunąć mikropipetę rejestrującą.
- Umieszczanie i pozycjonowanie mikropipet
- Za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml, niemetalowej igły do mikrostrzykawki i dedykowanego filtra, napełnić mikropipetę roztworem wewnętrznym przygotowanym wcześniej zgodnie z planowanym eksperymentem (roztwór wewnętrzny na bazie K+ lub Cs+, patrz Materiały dotyczące składu). Użyć wystarczającej ilości roztworu, aby roztwór wewnętrzny zetknął się z elektrodą z drutu srebrnego pokrytego chlorkiem w uchwycie mikropipety.
UWAGA: Elektrodę z drutu srebrnego można chlorować, mocząc ją w wybielaczu domowym. Trifosforany nukleozydów (trifosforan adenozyny, ATP i trifosforan guanozyny, GTP) można dodać do roztworu wewnętrznego przed użyciem. Strzykawkę zawierającą roztwór należy przechowywać na lodzie, aby zapobiec degradacji ATP/GTP.
- Upewnij się, że w mikropipecie nie ma pęcherzyków powietrza, ponieważ mogą one wydostać się na zewnątrz, gdy mikropipeta znajduje się w chusteczce i zasłaniać plasterek.
- Umieść mikropipetę w uchwycie elektrody tak, aby roztwór zetknął się z drutem elektrodowym pokrytym chlorkiem srebra.
- Dokręć nasadkę pipety tak, aby podkładka stożkowa utworzyła uszczelkę wokół mikropipety.
- Przed zanurzeniem mikropipety w płynie CSF należy zastosować nadciśnienie, aby zapobiec przedostawaniu się zanieczyszczeń do pipety.
- Ustaw stopień główny w pozycji zablokowanej (przodem do komory) i za pomocą mikromanipulatora poprowadź go w dół w kierunku komory tak, aby znajdował się mniej więcej pod środkiem zanurzonego obiektywu.
- Przesuwając mikropipetę za pomocą mikromanipulatora (ustawionego na średnią lub wysoką prędkość), użyj ekranu komputera, aby zlokalizować mikropipetę i skierować ją w kierunku położenia celi na osi XY.
- Zmierz rezystancję mikropipety, stosując krok napięcia (np. 4 mV przez 100 ms), który można wykonać ręcznie lub automatycznie za pomocą specjalnego oprogramowania, takiego jak tryb kąpieli, w przypadku korzystania z "testu membrany" w oprogramowaniu Clampex (patrz również krok 4). Aby upewnić się, że mikropipeta nie ma pęcherzyków powietrza ani żadnych innych ciał obcych, należy zastosować nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem (np. strzykawki o pojemności 30 cm3) połączonej z uchwytem mikropipety za pomocą rurki polietylenowej.
- Po wyczyszczeniu mikropipety należy wykonać przesunięcie napięcia, aby zredukować prąd pipety do zera, co można osiągnąć ręcznie lub za pomocą specjalnego oprogramowania, takiego jak "przesunięcie pipety" w sterowanym komputerowo sterowniku wzmacniacza.
UWAGA: Ta funkcja kompensuje wszelkie napięcia spowodowane różnicami stężeń między kąpielą a roztworami mikropipet (tj. potencjał złącza cieczy).
3. Test membranowy
UWAGA: Ten krok dotyczy wzmacniacza wymienionego w Materiałach.
- W przypadku korzystania ze sterowanego komputerowo sterownika wzmacniacza, zawsze ustawiaj go w trybie cęgów napięcia, aby wykonać test membrany.
UWAGA: Gdy test membranowy jest ustawiony w trybie "Kąpiel", test membranowy umożliwia pomiar rezystancji mikropipety i rezystancji uszczelki podczas formowania uszczelki.
- Po pęknięciu membrany (patrz krok 4.8) przełącz test membranowy w tryb "Komórka", aby można było uzyskać rezystancjęszeregową (R s) (zwaną również rezystancją dostępu, Ra), Ri i pojemnością membrany (Cp).
4. Końcowe podejście, formowanie pieczęci i uzyskiwanie konfiguracji całej komórki
- Za pomocą pokrętła precyzyjnego ustawiania ostrości zacznij ustawiać ostrość w dół, stopniowo opuszczając mikropipetę. Zawsze najpierw ustaw ostrość w dół, a następnie opuść mikropipetę do płaszczyzny ostrości. Zapewni to, że końcówka mikropipety nie wniknie gwałtownie w plasterek.
- Gdy mikropipeta zetknie się z powierzchnią plasterka, zmniejsz prędkość mikromanipulatora do trybu średnio-niskiego.
- Delikatnie zastosuj lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki wypełnionej powietrzem podłączonej do uchwytu pipety, aby usunąć wszelkie zanieczyszczenia ze ścieżki podejścia.
- Zbliżyć się do celi albo na przemian za pomocą pokręteł sterujących X-Y-Z, albo zbliżając się po przekątnej (jeśli pozwala na to model mikromanipulatora), gdzie obie osie X-Z są zmieniane wraz z obrotem pokrętła osi Z. Ta ostatnia metoda zapobiegnie pionowej kompresji tkanki.
UWAGA: Tutaj celem jest zbliżenie się do komórki poprzez zadanie minimalnych obrażeń plasterkowi. Gdy mikropipeta znajdzie się wystarczająco blisko komórki, pojawia się wgłębienie (okrągłe odbarwienie powierzchni komórki spowodowane nadciśnieniem wywieranym przez końcówkę mikropipety) (ryc. 2).
- Gdy pojawi się wgłębienie (Rysunek 2-1), przyłóż słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do rurki ssącej uchwytu pipety, aby uzyskać uszczelnienie (Rysunek 2-2). Kontynuuj monitorowanie testu membrany.
UWAGA: Jeśli powstaje częściowe uszczelnienie (<1 GΩ), wstrzykiwanie prądów ujemnych poprzez obniżenie potencjału podtrzymania (na sterowanym komputerowo sterowniku wzmacniacza) może ułatwić formowanie uszczelnienia i osiągnąć rezystancję gigaomów ("uszczelnienie gigaomowe" lub "gigauszczelnienie" >1 - 5 GΩ). Wysoka rezystancja uszczelki (>1 GΩ) zarówno ograniczy zanieczyszczenie hałasem rejestrowanego sygnału, jak i przyczyni się do stabilności mechanicznej łaty.
- Podczas tworzenia się gigaseal użyj sterowanego komputerowo sterownika wzmacniacza, aby zbliżyć potencjał utrzymywania komórki do fizjologicznego potencjału spoczynkowego (Vrest), aby zapobiec nagłym zmianom po pęknięciu błony. Na przykład MSN są zwykle napięte na poziomie -70 lub -80 mV (fizjologicznyspoczynek V: -70 do -90 mV).
- Po uformowaniu się gigaseal skompensuj szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Jeśli używasz sterowanego komputerowo amplifier sterownik, taki jak Multiclamp commander, naciśnij "Auto" dla "Cp Fast" i "Cp Slow".
- Jeśli uszczelnienie pozostaje stabilne i przekracza 1 GΩ (lub wstrzyknięcie mniej niż 10 - 20 pA, aby utrzymać komórkę na pożądanym potencjale błonowym), zastosuj krótkie i mocne ssanie przez tę samą rurkę, co w 4.5, aby rozerwać błonę plazmatyczną (Rysunek 2-3).
UWAGA: Może to wymagać kilku prób. Dobre pęknięcie membrany uzyskuje się, gdy ssanie jest wykonywane na tyle mocno, aby pęknięta membrana nie zatykała mikropipety (co może prowadzić do wzrostu Rs podczas nagrywania), ale na tyle słabo, aby nie zasysać dużej części błony lub komórki.
- Po pomyślnym skonfigurowaniu całej komórki należy regularnie monitorować położenie mikropipety, aby ocenić i skorygować znaczny dryft, ponieważ może to prowadzić do utraty łaty. Amplituda dryfu może się różnić w zależności od kilku czynników, np. jakości montażu zestawu i sił ciągnących działających na scenę główną. Idealnie byłoby, gdyby dryf prawie nie istniał.
- Przełączając się w tryb "Komórka" w teście membranowym, view różne parametrykomórki, takie jak R, i, Rs iCp . Monitoruj te parametry podczas nagrywania.
UWAGA: Wszystkie te parametry mogą pomóc w ocenie początkowego stanu zdrowia komórek i typów komórek (patrz sekcja "Test błonowy", krok 4).
