$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Różnicowanie rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC do neuronów na 6-dołkowych MEA i szklanych szkiełkach nakrywkowych
UWAGA: W tym protokole podane są szczegóły dotyczące różnicowania odwrotnych transaktywatorów sterowanych tetracykliną (rtTA)/ Neurogeniny-2 (Ngn2)-dodatnich hiPSC na 6-dołkowych MEA (urządzenia składające się z 6 niezależnych studzienek z 9 zapisami i 1 referencyjnym osadzonym mikroelektrodem na studzienkę).
- Przygotowanie wieloletnich porozumień dotyczących środowiska (dzień 0 i dzień 1)
- Dzień przed rozpoczęciem różnicowania MEA należy wysterylizować zgodnie z zaleceniami producenta.
- Rozcieńczyć białko adhezyjne poli-L-ornitynę (PLO) w sterylnej ultraczystej wodzie do końcowego stężenia 50 μg/ml. Pokryj obszar elektrody aktywnej 6-dołkowych MEA, umieszczając 100 μl kropli rozcieńczonego PLO w każdym dołku.
- Inkubować 6-dołkowe MEA przez noc (O/N) w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 . Następnego dnia odessać rozcieńczony PLO. Umyj szklane powierzchnie 6-dołkowych MEA dwukrotnie sterylną ultraczystą wodą.
- Rozcieńczyć lamininę w zmodyfikowanej mieszaninie Eagle i składników odżywczych F-12 (DMEM/F12) firmy Dulbecco do końcowego stężenia 20 μg/ml. Natychmiast pokryj aktywny obszar elektrody 6-dołkowych MEA, umieszczając kroplę 100 μl w każdym dołku.
- Inkubować 6-dołkowe MEA w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez co najmniej 2 godziny.
- Umieść na talerzu hiPSC (dzień 1)
UWAGA: Objętości wymienione w krokach 1.2.1 - 1.2.4 zakładają, że rtTA/Ngn2-dodatnie hiPSC są hodowane na płytce 6-dołkowej i że komórki z jednego dołka są zbierane. Objętości, które są wymagane do posiewu komórek na 6-dołkowych MEA, zależy od liczby 6-dołkowych MEA, które są używane w eksperymencie; Liczby określone w krokach od 1.2.6 do 1.2.8 umożliwiają skalowanie do różnych rozmiarów eksperymentu.
- Ciepły DMEM/F12, roztwór do odramiania komórek (CDS) i pożywka E8 z 1% (v/v) penicyliny/streptomycyny do R/T. Dodać doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml i inhibitora kinazy białkowej związanej z rho (ROCK) do pożywki E8.
- Odessać zużytą pożywkę rtTA/Ngn2-dodatnich hiPSC i dodać 1 ml CDS do hiPSC. Inkubować 3 - 5 minut w wilgotnym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 . Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki odłączają się od siebie.
- Dodać 2 ml DMEM/F12 do studzienki, delikatnie zawiesić komórki za pomocą pipety o pojemności 1 000 μl i przenieść komórki do probówki o pojemności 15 ml. Dodać 7 ml DMEM/F12 do zawiesiny komórek. Wiruj komórki w temperaturze 200 x g przez 5 minut.
- Odessać supernatant i dodać 2 ml przygotowanej pożywki E8. Oddziel hiPSC, przykładając końcówkę pipety o pojemności 1 000 μl do boku probówki o pojemności 15 ml i delikatnie zawieszając komórki. Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są zdysocjowane.
- Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
UWAGA: 6-dołkowa studzienka płytkowa przy zbiegu 80 - 90% zwykle daje łącznie 3,0 - 4,0 x 106 komórek.
- Odessać rozcieńczoną lamininę. W przypadku 6-dołkowych MEA rozcieńczyć komórki, aby uzyskać zawiesinę komórkową 7,5 x 105 komórek/ml. Płytkie ogniwa należy dodać, dodając kroplę 100 μl zawiesiny ogniw na obszar elektrody aktywnej w każdym dołku z 6-dołkowych MEA.
- Umieścić 6-dołkowe MEA w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 na 2 godziny.
- Po 2 godzinach ostrożnie dodać 500 μl przygotowanej pożywki E8 do każdego dołka z 6-dołkowych MEA. Umieścić 6-dołkowe MEA O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
- Zmień medium (dzień 2)
- Następnego dnia przygotuj DMEM/F12 z 1% (v/v) suplementem N-2, 1% (v/v) aminokwasami endogennymi i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać ludzką rekombinowaną neurotrofinę-3 (NT-3) do końcowego stężenia 10 ng/ml, ludzki rekombinowany czynnik neurotroficzny pochodzenia mózgowego (BDNF) do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Podgrzać podłoże do temperatury 37 °C.
- Dodać lamininę do końcowego stężenia 0,2 μg/ml do pożywki. Przefiltruj powstałe medium. Odessać zużytą pożywkę z dołków 6-dołkowych MEA i płytki 24-dołkowej i zastąpić ją przygotowanym podłożem. Inkubować 6-dołkowe MEA O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Dodaj astrocyty szczura (dzień 3)
UWAGA: Objętości wymienione w tym protokole zakładają, że astrocyty szczurów są hodowane w kolbach hodowlanych T75. Bardzo ważne jest, aby astrocyty szczurów dodawane do kultur były dobrej jakości. Używamy dwóch kryteriów, aby sprawdzić, czy astrocyty szczurów są dobrej jakości. Po pierwsze, hodowla astrocytów szczurów powinna być w stanie zlać się w ciągu dziesięciu dni po izolacji od embrionalnych mózgów szczurów. Po drugie, po podzieleniu kultury astrocytów szczurów, astrocyty szczurów powinny być w stanie utworzyć zlewającą się, mozaikową monowarstwę. Jeśli hodowla astrocytów szczurów nie spełnia tych dwóch kryteriów, radzimy nie używać tej kultury do eksperymentów różnicujących.
- Podgrzać 0,05% kwas trypsyno-etylenodiaminotetraoctowy (EDTA) do suchego tonu. Podgrzać sól fizjologiczną buforowaną fosforanem Dulbecco (DPBS) i DMEM/F12 z 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną do temperatury 37 °C.
- Odessać zużytą pożywkę z hodowli astrocytów szczura. Umyj kulturę, dodając 5 ml DPBS i delikatnie ją rozetrząśnij.
- Odessać DPBS i dodać 5 ml 0,05% trypsyny-EDTA. Delikatnie przetrząśnij trypsyną-EDTA. Inkubować w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 przez 5 - 10 minut.
- Sprawdź pod mikroskopem, czy komórki są odłączone. Odłączyć ostatnie komórki, uderzając kilka razy w kolbę.
- Dodać 5 ml DMEM/F12 do kolby. Delikatnie roztrzeć komórki wewnątrz kolby za pomocą pipety o pojemności 10 ml. Zebrać zawiesinę komórek do probówki o pojemności 15 ml. Wirować probówkę o masie 200 x g przez 8 minut.
- Odessać supernatant i ponownie zawiesić komórki w 1 ml DMEM/F12. Określ liczbę komórek (komórek/ml) za pomocą komory hemocytometru.
- Dodać 7,5 x 104 astrocyty na studzienkę 6-dołkowych MEA. Inkubować MEA O/N w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C w atmosferze 5% CO2 .
- Zmień podłoże (dzień 4)
- Przygotuj pożywkę neuropodstawową z 2% (v/v) suplementem B-27, 1% (v/v) L-alanylo-L-glutaminą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać NT-3 do końcowego stężenia 10 ng/ml, BDNF do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Ponadto dodać cytozynę β-D-arabinofuranozyd do stężenia 2 μM.
UWAGA: Cytozyna β-D-arabinofuranozyd jest dodawana do pożywki w celu zahamowania proliferacji astrocytów i zabicia pozostałych hiPSC, które nie różnicują się w neurony.
- Przefiltrować pożywkę i ogrzać ją do temperatury 37 °C. Odessać zużytą pożywkę z dołków 6-dołkowych MEA i zastąpić ją przygotowaną pożywką. Utrzymuj 6-dołkowe MEA w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
- Odśwież podłoże (dzień 6 - 28)
UWAGA: Począwszy od 6 dnia, odświeżaj połowę podłoża co dwa dni. Od 10 dnia pożywka jest uzupełniana płodową surowicą bydlęcą (FBS) w celu wsparcia żywotności astrocytów.
- Przygotuj pożywkę neuropodstawową z 2% (v/v) suplementem B-27, 1% (v/v) L-alanylo-L-glutaminą i 1% (v/v) penicyliną/streptomycyną. Dodać NT-3 do końcowego stężenia 10 ng/ml, BDNF do końcowego stężenia 10 ng/ml i doksycyklinę do końcowego stężenia 4 μg/ml. Począwszy od 10 dnia, należy również uzupełnić pożywkę o 2,5% (v/v) FBS. Przefiltrować powstałe podłoże i ogrzać do temperatury 37 °C.
- Za pomocą pipety o pojemności 1000 μl usunąć połowę zużytego podłoża z dołków 6-dołkowych MEA i zastąpić ją przygotowanym podłożem. Utrzymuj 6-dołkowe MEA w nawilżonym inkubatorze o temperaturze 37 °C z atmosferą 5% CO2 .
2. Ustal profil neurofizjologiczny neuronów pochodzących z hiPSC
UWAGA: Dwa do trzech tygodni po indukcji różnicowania, neurony pochodzące z hiPSC mogą być używane do różnych dalszych analiz. W tej sekcji podano przykłady niektórych dalszych analiz, które można przeprowadzić w celu ustalenia profilu neurofizjologicznego neuronów pochodzących z hiPSC.
- Scharakteryzowanie aktywności sieci neuronalnej za pomocą MEA
- Zapisz 20 minut aktywności elektrofizjologicznej neuronów pochodzących z hiPSC hodowanych na MEA. Podczas rejestracji należy utrzymywać temperaturę na poziomie 37 °C i zapobiegać parowaniu i zmianom pH pożywki poprzez nadmuchiwanie stałego, powolnego przepływu nawilżonego gazu (5%CO2, 20%O2, 75% N2) do MEA.
- Po wzmocnieniu 1200X (MEA 1060, MCS) próbkuj sygnał z częstotliwością 10 kHz za pomocą karty akwizycji danych MCS. Analizuj dane (wykrywanie skoków i serii) za pomocą niestandardowego pakietu oprogramowania.