Nagrania patch-clamp z dendrytu neuronu dopaminergicznego w wycinku mózgu

Streszczenie

Źródło: Engel, D. Subcellular Patch-clamp Recordings from the somatodendritic Domain of Nigral Dopamine Neurons. J. Vis. Exp. (2016).

Ten film demonstruje technikę nagrywania za pomocą zacisku krosowego z powierzchni membrany dendrytycznej. Pomaga to bezpośrednio badać właściwości elektryczne dendrytów i leżących u ich podstaw kanałów jonowych bramkowanych napięciem w neuronach dopaminergicznych.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.

1. Przygotowanie roztworów

1. Standardowy sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF; Tabela 1)
   1. Używaj soli o wysokiej czystości i czystych szklanych zlewek uprzednio spłukanych wodą podwójnie destylowaną, aby przygotować świeży roztwór. Do przygotowania wszystkich roztworów zewnątrz- i wewnątrzkomórkowych używaj wysokiej jakości wody podwójnie destylowanej.
   2. Zgodnie z tabelą 1 weź zlewkę o pojemności 2 l, aby rozpuścić NaHCO₃ w 500 ml wody, a drugą do rozpuszczenia innych soli, aby zapobiec wytrącaniu się jonów dwuwartościowych. Systematycznie czyść szpatułkę wodą podwójnie destylowaną i osusz ją przed zażyciem soli. Użyj mieszadła magnetycznego do homogenizacji rozpuszczenia. Dodać roztwory z obu zlewek do odpowiedniej kolby miarowej i doprowadzić je do odpowiedniej objętości.
   3. Upewnij się, że końcowy roztwór zewnątrzkomórkowy jest całkowicie przezroczysty i bez śladów wytrącania się.
   4. Mieszaninę gazów składającą się z 95% O₂ i 5% CO₂ (gaz karbonowy) nanieść za pomocą szklanej świecy z mikrofiltrem (Ø 13 mm) 20 - 30 minut przed perfuzją plastrów. Dokładnie kontroluj osmolarność (2 - 3 kolejne pomiary) ACSF za pomocą osmometru (optymalny zakres: 314 - 325 mOsmol/L). Pozostały roztwór po przygotowaniu przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
2. Roztwór do cięcia (sacharoza-ACSF; Tabela 2)
   1. Przygotuj 3 l świeżego roztworu. Użyj 1 litra do przygotowania plastrów mózgu z jednego zwierzęcia. Pozostały roztwór należy przechowywać w temperaturze 4 °C i zużyć w ciągu 3 dni.
      UWAGA: Wysokie stężenia Mg^{2 +} i niskie Ca^{2 +} są stosowane w celu zmniejszenia transmisji synaptycznej, a część NaCl zastępuje się sacharozą w celu zachowania tkanki.
3. Roztwory wewnątrzkomórkowe
   1. Przygotować wcześniej 100 ml roztworu do zapisu z podwójnymi całymi komórkami (Tabela 3).
   2. Uwzględnij siarczan metylu, aby uzyskać dobre odzyskiwanie morfologii komórek. Dodaj biocytynę (0,1 - 0,4%), aby następnie zbadać morfologię neuronu. Dołącz barwnik fluorescencyjny (np. Alexa 594 lub sulforodamina 101 41), aby śledzić rozszerzanie dendrytów podczas nagrywania (opcjonalnie).
   3. Przygotować wcześniej 100 ml roztworu elektrody do zapisów podłączonych do ogniw (Tabela 4). W tym przypadku roztworem wewnętrznym jest roztwór o wysokiej zawartości K⁺ przeznaczony do izolowania makroskopowego prądu kationowego aktywowanego hiperpolaryzacją (Ih) i zawiera blokery dla innych kanałów jonowych bramkowanych napięciem.
   4. Roztwory wewnątrzkomórkowe należy przechowywać w 2 ml podwielokrotnościach w temperaturze -20 °C. Używać nowej porcji dla każdej nowej sesji nagraniowej. Sprawdź dokładnie osmolarność każdej rozmrożonej podwielokrotności za pomocą osmometru. Weź nową podwielokrotność, jeśli osmolarność nie odpowiada wartości początkowej.
   5. Przenieść roztwór z podwielokrotności do strzykawki o pojemności 3 ml, na której umieszczono sterylny filtr strzykawkowy 0,22 μm. Podczas sesji nagraniowej należy trzymać strzykawkę na lodzie, aby ograniczyć degradację zawartych w niej związków (ATP, GTP lub fosfokreatyny).

2. Produkcja i napełnianie pipety z plastrem

1. Ciągnąc
   1. Użyj poziomego ściągacza elektrod i grubościennych rurek ze szkła borokrzemianowego. W przypadku nagrań z całych komórek i dołączonych do komórek należy użyć średnicy zewnętrznej 2 mm / średnicy wewnętrznej 1 mm. Upewnij się, że szklana rurka jest absolutnie czysta.
   2. Jeśli tak nie jest, najpierw zanurz szklane kapilary w rozpuszczalniku organicznym (np. etanolu), a następnie w wodzie podwójnie destylowanej. Krótko podgrzej zakończenia kapilarne za pomocą palnika Bunsena. Alternatywnie można zamówić rurki szklane umyte i podgrzane bezpośrednio u producenta (patrz Lista materiałów).
   3. W przypadku podwójnych zapisów somatodendrytycznych należy upewnić się, że rezystancja pipet somatycznych wynosi od 6 do 10 MΩ i od 8 do 19 MΩ w przypadku pipet dendrytycznych po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym (Tabela 3). Standaryzacja rezystancji pipet dla nagrań podłączonych do komórek do rezystancji 10 MΩ, aby osiągnąć porównywalne wyniki wzdłuż domeny somatodendrytycznej neuronu.
   4. Przygotuj nowe pipety przed każdą sesją nagraniową (codziennie) lub bezpośrednio przed łataniem i używaj ich 5 - 8 godzin po ich wyprodukowaniu. Pipety należy przechowywać w zakrytym szklanym pojemniku, aby chronić je przed kurzem i zatkaniem końcówki.
2. polerowanie
   1. Sprawdź i wypoleruj termicznie każdą końcówkę pipety za pomocą mikrokuźni, aby uzyskać lepsze uszczelnienie z membraną. Przed użyciem mikrokuźni rozpuść mały kawałek szkła na platynowym włóknie grzewczym. Codziennie wymieniaj tę szklaną powłokę na włókno platynowe, aby zapewnić stałość (Peter Jonas, komunikacja osobista).
      nuta: Pipety używane do nagrań z ogniwami mogą być powlekane przed etapem polerowania termicznego w celu zmniejszenia szumów tła. Do powlekania pipet można użyć środka izolacyjnego, takiego jak stopiony wosk dentystyczny lub elastomer silikonowy.

3. Przygotowanie wycinków mózgu

1. Używaj zdrowych szczurów Wistar w wieku od 16 do 19 dni. Nie używaj zwierząt niezdrowych lub cierpiących na hipotermię lub odwodnienie. Przed przystąpieniem do przygotowania plastrów należy trzymać zwierzę w bezpiecznym i cichym miejscu. Unikaj przebywania innych zwierząt w pomieszczeniu podczas przygotowywania zwierzęcia. Delikatnie manipuluj zwierzętami.
2. Wlać sacharozę-ACSF do dwóch zlewek z polipropylenu (PP) o pojemności 400 ml i umieścić je w zamrażarce o temperaturze -80 °C na 45 minut. Wymieszać roztwór, aby uzyskać jednorodny lodowaty płyn/zamrożony roztwór i umieścić zlewki na lodzie. Roztwór sacharozy-ACSF należy nasycić gazem karbogenicznym za pomocą świecy mikrofiltra (Ø 13 mm) w każdej zlewce PP.
3. Przygotuj krajalnicę i komorę rezerwową
   1. Używaj wysokiej jakości krajalnicy do tkanek o wyjątkowo niskich wibracjach pionowych, aby w jak największym stopniu zminimalizować uszkodzenia powierzchownych warstw plastrów. Napraw świeżą i całą żyletkę na krajalnicy.
   2. Używaj nowej żyletki do każdej sesji strzyżenia. Unikaj zginania żyletki. Nie usuwaj filmu tłuszczowego z powierzchni żyletki (Josef Bischofberger, komunikacja osobista).
   3. Jeśli to możliwe, sprawdź wibracje pionowe za pomocą sondy wibracyjnej dostarczonej przez producenta. Alternatywnie użyj niestandardowej sondy wibracyjnej. Zmniejsz drgania pionowe ostrza tak, aby były jak najbardziej zbliżone do 0 μm.
   4. Przygotuj komorę rezerwową o pojemności 150 ml na plastry. Wlej standardowy ACSF do komory rezerwowej i umieść go w łaźni wodnej. Zasilić roztwór komory rezerwowej karbogenem za pomocą świecy mikrofiltracyjnej (Ø 6 mm). Upewnij się, że pęcherzyki karbogenu są tak małe, jak to możliwe.
      nuta: Buduj nową komorę rezerwową co 2-3 miesiące, aby utrzymać stałą jakość plastrów.
4. Pokrój plastry
   1. W cichym pomieszczeniu, w którym eksperymentator nie jest niepokojony ani zestresowany, odetnij zwierzę nożyczkami chirurgicznymi (długość 150 mm) na poziomie rdzenia szyjnego.
   2. Przeciąć skórę na czubku głowy zwierzęcia w kierunku od nosa do ogona za pomocą skalpela i usunąć ją na boki. Odetnij czubek czaszki od ogona do nosowej części głowy cienkimi nożyczkami i usuń obie części czaszki z boku. Wyjąć mózg cienką szpatułką i ostrożnie wrzucić go do zlewki PP zawierającej lodowatą (0 - 4 °C) sacharozę-ACSF zrównoważoną karbogenem.
      nuta: Tę sekwencję kroków należy wykonać tak szybko, jak to możliwe, ale także skrupulatnie (<<1 min, około 40 s).
   3. Trzymaj mózg w roztworze zlewki PP przez ~2 do 5 minut. Dostosuj ciśnienie karbogenu, aby zapobiec ruchom mózgu. Jeśli pęcherzyki karbogenu są zbyt duże, wymień świecę mikrofiltra na nową.
   4. Umieść mózg na 9 cm szalce Petriego, której wewnętrzne dno pokryte jest warstwą Sylgarda o grubości ~0,5 cm. Przygotuj tę szalkę Petriego z wyprzedzeniem.
   5. Otocz mózg lodowatą sacharozą-ACSF. Upewnij się, że jakaś faza ciekła roztworu sacharozy ACSF zanurza się w mózgu. W przypadku plastrów koronalnych odetnij przednią część mózgu w płaszczyźnie koronalnej skalpelem lub żyletką. Usuń móżdżek za pomocą cięcia koronalnego.
   6. Nałóż klej cyjanoakrylowy na tackę na próbki (powierzchnia ~1 cm²). Wklej blok mózgu tak, aby część czołowa była skierowana w stronę etapu krojenia. Ostrożnie wlej sacharozę-ACSF na wierzch wklejonego mózgu za pomocą dużego otworu szklanej pipety Pasteura, a następnie powoli zanurz komorę tnącą krajalnicy. Manewruj tacą na próbki tak, aby powierzchnia cięcia (tj. pierwsza tkanka, która uderzy w ostrze) była brzuszną powierzchnią mózgu.
   7. Nanosić karbogen za pomocą zakrzywionej szklanej świecy mikrofiltracyjnej (Ø 6 mm) do komory tnącej (opcjonalnie).
   8. Wyreguluj żyletkę pod kątem ~15° w stosunku do płaszczyzny poziomej. Wytnij koronalne plastry mózgu o wielkości ~ 500 μm w kierunku ogonowym do nosa przed dotarciem do istoty czarnej. Zmniejsz grubość, aby wyciąć plastry o grubości 300 - 350 μm zawierające interesujący Cię obszar.
   9. Oddziel plastry od bloku tkanki za pomocą bardzo cienkiej igły perfuzyjnej przymocowanej do strzykawki równolegle do krawędzi żyletki. Zgiąć igłę tak, aby między igłą a strzykawką znajdował się kąt 90°. Upewnij się, że nie jest wywierany nacisk na żyletkę podczas wyjmowania plastra z bloku tkanki.
5. Przechowuj plastry
   1. Przenieść plastry za pomocą największego otworu szklanej pipety Pasteura (przymocowanej do bańki) do komory rezerwowej. Po przeniesieniu wszystkich plastrów do komory rezerwowej (Christoph Schmidt-Hieber, komunikacja osobista) należy doprowadzić temperaturę łaźni wodnej do 34 °C na 0,5 - 1 godzinę.
   2. Po tym okresie wyłącz łaźnię wodną i utrzymuj plastry w temperaturze pokojowej. Wyreguluj ciśnienie karbogenu, aby uniknąć ruchów plastrów w komorze rezerwowej. Trzymaj plasterki przez kolejne 10 do 20 minut przed rozpoczęciem nagrywania.
   3. Wyczyść sprzęt i świece mikrofiltra ostrożnie, ale dokładnie, wodą podwójnie destylowaną pod koniec procedury krojenia.

4. Podwójne zapisy somatyczne i somatodendryczne w neuronach nigralnych i archiwizacji biocytyny

1. Postępuj zgodnie z opisami montażu zestawu zacisku krosowego dla plasterków podanymi w przewodniku The Axon Guide.
2. Przygotuj komorę nagraniową
   1. Umieścić 1 - 2 ml podwójnie destylowanej wody w komorze nagrywającej. Sprawdź, czy nie jest nieszczelny. Umieść komorę nagrywania na przesuwanym stole x-y.
   2. Wprowadzić standardowy ACSF przez nieprzepuszczalny dla tlenu system rurek perfuzyjnych (politetrafluoroetylen) do komory rejestracyjnej. Ustabilizować przepływ perfuzji w komorze z szybkością 4 - 5 ml ^min-1. Długość rurki łączącej zlewkę zawierającą ACSF z komorą zapisu powinna być jak najkrótsza (1 m).
   3. Wybierz wycinek mózgu z komory rezerwowej i przenieś go do komory zapisu, korzystając z największego otworu szklanej pipety Pasteura. Przykryj plasterek platynowym pierścieniem, aby zakotwiczyć go na dnie komory nagrywania. Użyj płaskiego platynowego pierścienia (Ø 1,5 cm) i przyklej do niego równoległe nylonowe nici (rozstaw >2 mm).
3. Dostosuj i zoptymalizuj optykę
   1. Wizualizacja wycinków za pomocą mikroskopii wideo w podczerwieni (IR). Wyreguluj oświetlenie Köhler 51 i zoptymalizuj optykę kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) lub oświetlenie ukośne (kontrast gradientowy Dodt - DGC).
   2. Sprawdź jakość plasterka. Trzymaj tylko plastry o gładkich i równych powierzchniach, które nie są zbyt mocno skontrastowane i mają tylko małe, rozproszone kratery.
   3. Napełnij 2 świeże i nieużywane pipety plastrowe roztworem wewnątrzkomórkowym (Tabela 3). Za pomocą probówki o pojemności 0,5 ml zawierającej roztwór pipety należy napełnić końcówkę pipety metodą kapilarną. Aby przyspieszyć napełnianie końcówek pipet bez filamentu, należy przyłożyć podciśnienie do końca pipety za pomocą rurki dołączonej do strzykawki.
4. Umieść pipety nad powierzchnią plastra
   1. Sprawdź obecność powłoki chlorkowej na srebrnych drutach.
   2. Wkładaj pipety kolejno do uchwytów na pipety i stosuj nadciśnienie (~70 mbar) za pomocą obwodu rurki łączącego uchwyt pipety, kran trójdrożny i manometr. Opuścić pipetę do kąpieli komory nagrywającej.
   3. Sprawdź, czy wartość ciśnienia na manometrze jest stała przez ~1 - 2 min. Jeśli ciśnienie spada, sprawdź rurki lub pierścienie uszczelniające o przekroju okrągłym wewnątrz uchwytu pipety.
   4. Umieść końcówkę pipety na środku monitora wideo i upewnij się, że nie jest zasłonięta. Upewnij się, że końcówka pipety nie porusza się podczas wywierania lub zwalniania nacisku na pipetę.
   5. Sprawdź, czy końcówka pipety nie jest znoszona i czy nie ma drgań, rysując mały krzyżyk na środku monitora dokładnie w miejscu, w którym znajduje się końcówka pipety i obserwuj przez 5 minut możliwe ruchy końcówki.
   6. Zastosuj krok napięcia (5 mV), aby monitorować rezystancję pipety na oscyloskopie. Ustaw potencjał podtrzymania wzmacniacza patch-clamp na 0 mV. Anuluj potencjał przesunięcia pipety w taki sposób, aby prąd pipety DC wskazywał zero na mierniku wzmacniacza.
   7. Przesuń pipety w dół do plastra i utrzymuj je nad powierzchnią.
5. Wybierz i załataj neuron długimi dendrytami
   1. W istocie czarnej wybierz zdrowy neuron z długimi dendrytami, który można śledzić na dużą odległość w przybliżeniu w tej samej płaszczyźnie (ryc. 1A i 1B) za pomocą kontrastu gradientowego IR-Dodt (IR-DGC). Wybierz gładki i jednorodny korpus komórki. Należy unikać dwóch silnie kontrastujących komórek na powierzchni wycinka (rysunek 1C i 1D), ponieważ trudno jest się włamać i zachować stabilne warunki nagrywania w czasie (stabilna rezystancja szeregowa). Wybierz neurony, które mają somę 10 - 30 μm pod powierzchnią warstwy.
   2. Przesuń elektrodę somatyczną blisko somy (40 - 50 μm odległości), a elektrodę dendrytyczną blisko dendrytu w tej samej odległości. Użyj 2-krotnego powiększenia (czterokrotny zmieniacz), aby wybrać i załatać część dendrytu. Uzyskaj na monitorze powiększenie bezwzględne 2 100X bez powiększenia (1X) i 5 500X z powiększeniem 2X.
   3. Nieznacznie zmniejszyć ciśnienie pipety somatycznej o 10 mbar. W razie potrzeby wyreguluj ciśnienie w pipetach dendrytycznych i somatycznych, aby uniknąć przemieszczenia struktury komórkowej (somy i dendrytu) w plastrze.
   4. Umieść pipetę dendrytyczną blisko membrany, aby zobaczyć małe wgłębienia. Zwolnij nacisk na końcówkę pipety i załataj dendryt, kontrolując opór pipety. W idealnych warunkach wystarczy bardzo niewielkie ssanie, aby uzyskać dobre uszczelnienie.
   5. Zmniejsz amplitudę stanów przejściowych pojemności pipety tak bardzo, jak to możliwe, na szczycie kroku prądowego, używając impulsu napięciowego o wysokim wzmocnieniu i niewielkim filtrowaniu 51 oraz oscyloskopu. Wejdź w tryb całej komórki za pomocą pipety dendrytycznej.

Wyniki

Tabela 1: Sztuczny płyn mózgowo-rdzeniowy (ACSF)

TGL TGL Cz...

substancja	g/mol	koncentracja	na 1 L
Zawartość NaCl	58.443	125 mM	7.305 gr
NaHCO3	84.007	25 mM	2.100 gr
Kcl	74.551

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Woda podwójnie destylowana	Milipory	Super Q	Rezystywność >14 MΩ cm, idealna 18,2 MΩ cm w temperaturze 25°C, filtrowana (0,22 μm), https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Super-Q-Plus-Water-Purification-System,MM_NF-C1760
Świece z mikrofiltrem	Robu powiedział:	Porowatość o średnicy 3, 6 mm lub 13 mm
Krajalnica do tkanek z wibrosondą	Księga Leica	Zobacz materiał VT1200	parametry cięcia: prędkość 0,07, amplituda 1,40
Krajalnica do tkanek	Dosaka	Przekaźnik DTK-1000	parametry cięcia: prędkość 4, częstotliwość 7
Żyletki	Gilette powiedział:	Super Srebrny
Narzędzia do preparowania	Braun, Aesculap
Komora rezerwowa			Zamówienie
Zaczepy PP	Firma VWR	213-1725	Pojemność 400 ml
Filtr strzykawkowy	Merk Millipore	Millex - GV 0,22 μm
Klej cyjanoakrylowy	UHU powiedział:	"Sekunden Kleber"	klej w płynie
Komora nagraniowa	Luigs & Neumann	Mini komora Slice
Poziomy ściągacz do pipet	Instrumenty Sutter	Brązowo-płonący P-97
Pipety	Hilgenberg	1807524	Szklane kapilary o średnicy wewnętrznej 2 mm / średnicy wewnętrznej 1 mm, końce polerowane ogniowo, myte
Wosk dentystyczny	Coltène/Wieloryb		paski woskowe do tacek ortodontycznych
Siatka platynowa			do zakotwiczenia plastrów w komorze nagraniowej, wykonane na zamówienie z platynowym krążkiem
Mikrokuźnia	Narishige powiedział:	MF-830	do polerowania ognistego końcówek do pipet
Siarczan metylu potasu	MP Biomedycyna	215481
Biocytyna	Sondy molekularne	Zobacz materiał B1592
manometr	GREISINGER elektroniczny	GDH 13 AN
mikroskop	Zeiss	Fs
Kontrast gradientu Dodt	Luigs & Neumann
Manipulatory	Luigs & Neumann	LN Mini 25
Chwytak klatek	Źródło obrazowania	Złącze DFG/USB2pro
kamera	DAGE-MTI (krajowa firma DAGE-MTI	NC-70
kondensator	Zeiss		Kondensor o dużej aperturze numerycznej pracujący z olejem
cel	Zeiss	W Plan Apochromat 441470-9900 VIS-IR	63-krotne powiększenie, duże odległości, obiektyw 1,0 do zanurzenia w wodzie z dużą aperturą numeryczną
Czteroczęściowy zmieniacz	Luigs & Neumann		między kamerą a mikroskopem
Czarno-biały monitor wideo	Sony	Zobacz materiał SSM-175CE	16-calowy, 850 linii telewizyjnych, analogowy
Butelki na próbki, szkło bursztynowe, z nakrętką	Firma VWR	215-2409	do przenoszenia wycinków z zestawu do pomieszczenia histologicznego
Przewodnik po firmie Axon	Urządzenia molekularne		książka
Paraformaldehyd	Sigma	441244	przed użyciem zapoznaj się z KARTĄ CHARAKTERYSTYKI i dyrektywą w sprawie substancji niebezpiecznych (UE)
Studnia Płytka do hodowli komórkowej	Greiner-Bio-One	Numer katalogowy: 662160	do barwienia utrwalonych plastrów
Tryton X-100	Merk	108643	przed użyciem zapoznaj się z KARTĄ CHARAKTERYSTYKI i dyrektywą w sprawie substancji niebezpiecznych (UE)
Technologia zapobiegająca blaknięciu ProLong Diamond	Sondy molekularne - Thermo Fisher Scientific	Zobacz materiał P36961