Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Zapisy elektrofizjologiczne do badania spontanicznej i zależnej od stymulacji elektrod aktywności
- Przemyć kulturę z matrycą wieloelektrodową (MEA) roztworem zewnątrzkomórkowym w temperaturze pokojowej (RT).
- Osusz styki chusteczką i zamontuj MEA na konfiguracji MEA.
nuta: Aby kultura była wilgotna podczas montowania, dodaj do kultury niewielką kroplę roztworu zewnątrzkomórkowego.
- Dodać 300 μl roztworu zewnątrzkomórkowego i odczekać 10 minut przed nagraniem, aby system mógł się ustabilizować.
- Rejestruj spontaniczną aktywność przez 2 minuty ze wszystkich elektrod, naciskając przycisk nagrywania/pobierania w oprogramowaniu i zidentyfikuj elektrody rejestrujące.
- Stymulacja elektrod MEA: Wybierz amplitudę/czas trwania/kształt bodźca w odpowiednim oprogramowaniu i zastosuj go do kilku elektrod po kolei. Wybierz elektrody na podstawie tych, które wykazują spontaniczną aktywność (jak w kroku 1.4). Nagrywaj ze wszystkich pozostałych elektrod.
- Aby wykluczyć artefakt stymulacji, stymuluj z tej samej elektrody 10 razy. Jeśli hodowla zareaguje co najmniej 8 na 10 razy, można założyć, że jest to pozytywna odpowiedź na stymulację wywołaną elektrodą.
- Aby zidentyfikować szum tła, należy nałożyć tetrodotoksynę (TTX) na hodowlę w stężeniu 1 μM, aby zablokować kanały sodowe bramkowane napięciem i nagrywać przez 2 minuty. Użyj tego, aby przeprowadzić wykrywanie skoków (2.1 i 2.2).
2. Analiza danych
- Za pomocą odpowiedniego oprogramowania można wykryć spontaniczną aktywność każdej elektrody za pomocą detektora opartego na odchyleniach standardowych i późniejszym dyskryminatorze. Aktywność pojawia się jako szybkie stany przejściowe napięcia (<5 ms).
- Wybierz próg, który powoduje brak aktywności podczas analizowania próbek poddanych działaniu TTX. Dostosuj wartość progową dla każdego eksperymentu, aby odróżnić wykrycia fałszywie dodatnie od fałszywie ujemnych.
- Za pomocą odpowiedniego oprogramowania obserwuj wykrytą aktywność neuronalną każdej elektrody jako wykres rastrowy zgodnie ze standardowymi procedurami (patrz rysunek 1A-C).
- Określ i wyświetl całkowitą aktywność sieciową, sumując wszystkie wykryte zdarzenia w przesuwanym oknie o długości 10 ms, przesuniętym o krok 1 ms.
- Wykrywaj aktywność wywołaną stymulacją, wyświetlając surowe dane za pomocą odpowiedniego oprogramowania analitycznego. Zidentyfikuj pojedyncze skoki w trybie offline ręcznie. Pojedyncze skoki pojawiają się jako szybkie stany przejściowe napięcia, występujące po artefakcie stymulacji (grot strzałki na rysunku 1E). Przykład pokazano na rysunku 1E.
- W zależności od eksperymentu przeanalizuj liczbę reagujących elektrod, próg potrzebny do osiągnięcia odpowiedzi, liczbę potencjału czynnościowego na elektrody i inne interesujące parametry.
