Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
UWAGA: Każdy uczestnik biorący udział w procedurze musi być odpowiednio przeszkolony w zakresie podstawowych procedur chirurgicznych i musi posiadać ważną licencję na przeprowadzanie eksperymentów na zwierzętach.
1. Znieczulenie i premedykacja
- Znieczulić szczura wstrzyknięciami dootrzewnowymi pentobarbitalu sodu (dawka początkowa 60 mg·kg-1 dla 6-miesięcznych samców szczurów rasy Wistar o wadze 400\u2012550g).
nuta: Protokół ten nie jest ograniczony do wskazanego szczepu, płci lub wieku szczurów. Można również zastosować alternatywne znieczulenie, takie jak mieszanina ketaminy i ksylazyny, alfa-chloraloza lub fentanyl + midazolam + medetomidyna, jeśli są bardziej odpowiednie dla różnych celów badawczych lub gdy jest to wymagane przez komisję etyczną.
- Po około 5 minutach sprawdź głębokość znieczulenia, ściskając palec tylnej kończyny szczura kleszczami. Kontynuuj kolejne kroki protokołu tylko wtedy, gdy nie zaobserwuje się odruchowego działania.
- Wstrzyknąć podskórnie 0,05 ml atropiny w celu zmniejszenia produkcji śluzu po intubacji.
- Wstrzyknąć podskórnie 5 ml buforu fosforanowego zawierającego 4% roztwór glukozy, NaHCO3 (1%) i żelatynę (14%). Ten bufor będzie wchłaniany przez naczynia skórne przez cały czas trwania eksperymentu i pomoże utrzymać równowagę płynów.
- Przez cały czas trwania zabiegu należy okresowo sprawdzać zwierzę pod kątem działań odruchowych i w razie potrzeby uzupełniać znieczulenie (10 mg·kg-1· h-1 pentobarbitalu sodu).
2. Chirurgia
- Przygotuj zwierzę do leczenia chirurgicznego, goląc futro nad grzbietową częścią lewej kończyny tylnej, od kostki do biodra, grzbietu, od ogona do wysokich segmentów piersiowych (Th), lewej strony klatki piersiowej i brzusznej strony szyi powyżej mostka
- Umieszczenie linii dożylnej
- Połóż szczura na plecach na poduszce grzewczej w zamkniętej pętli (i zabezpiecz ją mocowaniami kończyn).
- Za pomocą 21 ostrzy wykonaj podłużne cięcie przez skórę od mostka do podbródka.
- Przytrzymaj skórę kleszczami i oddziel ją od leżącej pod nią tkanki.
- Stosując techniki preparowania, odsłoń prawą żyłę szyjną. Ostrożnie wypreparuj żyłę z otaczających tkanek.
- Zlokalizuj część żyły bez punktów rozgałęzień i wsuń pod nią dwie ligatury 4-0.
- Wykonaj jeden luźny węzeł na bliższym końcu wcześniej zidentyfikowanego nierozgałęzionego odcinka żyły i jeden luźny węzeł na dystalnym końcu tego odcinka żyły. Zaciśnij żyłę proksymalnie do serca, a następnie podwiąż dystalną część żyły.
- Za pomocą nożyczek do tęczówki wykonaj nacięcie między zaciskiem a odległą ligaturą. Przytrzymaj płatek żyły i wprowadź wstępnie wypełniony cewnik do punktu, w którym jest zablokowany przez zacisk.
- Przytrzymując żyłę i cewnik razem kleszczami, zdejmij zacisk i wepchnij cewnik na kilka milimetrów do żyły. Przymocuj oba końce cewnika do żyły i dodaj dodatkowy punkt mocowania do skóry.
3. Wprowadzenie rurki dotchawiczej
- Za pomocą kleszczy oddziel dwa gruczoły żuchwowe pokrywające mięśnie mostkowo-gnykowe. Oddziel mięśnie mostkowo-gnykowe w linii środkowej, aby odsłonić tchawicę.
- Wsuń trzy ligatury 4-0 pod tchawicę, a następnie wykonaj dwa węzły poniżej punktu wprowadzenia rurki dotchawiczej i jeden węzeł powyżej.
- Zlokalizuj chrząstkę krtaniową i wykonaj nacięcie poniżej trzeciej chrząstki tchawicy.
- Włóż rurkę dotchawiczą do tchawicy i zabezpiecz rurkę na miejscu za pomocą wcześniej przygotowanych ligatur, a następnie dodaj dodatkową ligaturę do skóry.
- Umieść mały kawałek waty nad oddzielonymi mięśniami i zszyj skórę na operowanym obszarze.
4. Rozwarstwienie nerwów kończyn tylnych
- Za pomocą ostrza 21 wykonaj podłużne cięcie po tylnej stronie lewej kończyny tylnej, od ścięgna Achillesa do biodra.
- Chwyć skórę kleszczami i za pomocą technik preparowania oddziel skórę od leżących pod nią mięśni po obu stronach nacięcia.
- Zlokalizuj dół podkolanowy z tyłu stawu kolanowego, który jest pokryty mięśniem dwugłowym uda, i za pomocą nożyczek wykonaj cięcie między przednią i tylną częścią tego mięśnia.
- Poruszając się w górę, odetnij dwie głowy bicepsa, kości udowej aż do biodra, aby odsłonić nerw kulszowy. Kauteryzuj w razie potrzeby, aby zapobiec krwawieniu.
- Zidentyfikuj gałęzie łydki, piszczelowe i strzałkowe nerwu kulszowego.
- Za pomocą nożyczek oddziel boczną od przyśrodkowej głowę mięśnia brzuchatego łydki, aby odsłonić nerw piszczelowy i jego gałęzie.
- Za pomocą 55 kleszczy chwyć dystalny koniec nerwu łydkowego, przetnij go dystalnie i wypreparuj tak daleko, jak to możliwe.
- Powtórz procedurę ze wspólnym nerwem strzałkowym.
- Za pomocą szklanego pręta oddziel nerw piszczelowy od otaczających tkanek, uważając, aby nie uszkodzić naczyń krwionośnych, i przetnij go dystalnie.
- Zidentyfikuj nerw brzuchaty łydki przyśrodkowego (MG) oraz nerwy brzuchate łydki i płaszczkowate boczne (LGS).
- Za pomocą 55 kleszczy ostrożnie wypreparuj nerwy MG i LGS, odłączając je od otaczających tkanek, ale zachowując ich połączenie z odpowiednimi mięśniami.
- Umieść nasączony solą fizjologiczną kawałek waty pod odsłoniętymi nerwami.
- Zamknij skórę nad operowanym obszarem.
5. Laminektomia
- Za pomocą ostrza 21 wykonaj podłużne nacięcie od kości krzyżowej do kręgów piersiowych.
- Oddziel skórę od mięśni leżących pod spodem.
- Przetnij mięsień najdłuższy po obu stronach wyrostków kolczystych piersiowych i lędźwiowych.
- Za pomocą skalpela o krawędziach wycofaj mięśnie z kręgosłupa, aby odsłonić wyrostki poprzeczne każdego kręgu.
- Za pomocą nożyczek z końcówką przetnij ścięgna mięśni połączonych z wyrostkami poprzecznymi wzdłuż odsłoniętego kręgosłupa. W razie potrzeby zastosuj środki hemostatyczne.
- Zidentyfikuj kręg Th13 jako najniższy segment piersiowy z przyczepem żebrowym i za pomocą drobnych rongeurs usuń wyrostki kolczyste i blaszki z kręgów Th13 do L2, aby odsłonić odcinki lędźwiowe rdzenia kręgowego. Pamiętaj, aby nie uszkodzić wyrostka kolczystego L3, który posłuży jako punkt mocowania do stabilizacji kręgosłupa.
- Usuń wyrostek kolczysty Th12 i wygładź powierzchnię grzbietową kręgu tak bardzo, jak to możliwe.
- Stosując techniki preparowania, oddziel mięśnie od kręgu Th11, aby utworzyć punkty wprowadzenia uchwytu.
- Umieść cienką, nasączoną solą watę na odsłoniętych segmentach rdzenia kręgowego.
- Przenieś szczura do wykonanej na zamówienie metalowej ramy z dwoma równoległymi prętami i dwoma regulowanymi ramionami z zaciskami do podparcia i stabilizacji kręgosłupa.
6. Przygotowanie do nagrania i stymulacji
- Zespolenie kręgosłupa i ułożenie nerwów
- Umieść szczura w specjalnie wykonanej ramie na poduszce grzewczej podłączonej do systemu grzewczego w pętli zamkniętej, aby utrzymać temperaturę ciała zwierzęcia na poziomie 37 ± 1°C.
- Włóż elektrody elektrody elektrokardiogramu (EKG) pod skórę i podłącz do amplifier w celu monitorowania tętna.
- Za pomocą płatów skóry utwórz głęboką kałużę nad odsłoniętym rdzeniem kręgowym.
- Za pomocą metalowych zacisków przymocuj kręgosłup, umieszczając zaciski poniżej wyrostków poprzecznych Th12 i wyrostka kolczystego L3.
- Upewnij się, że kręgosłup jest zabezpieczony i ułożony poziomo, a następnie zastosuj nacisk grzbietowo-brzuszny po obu stronach kolumny, aby cofnąć mięśnie.
- Napełnij basen ciepłym (37 °C) olejem mineralnym i utrzymuj go w tej temperaturze.
- Przewlecz ligaturę 4-0 przez ścięgno Achillesa, unieś i rozciągnij operowaną lewą tylną kończynę tak, aby kostka zrównała się z biodrem.
- Używając płatów skóry, wykonaj głęboką kałużę nad odsłoniętymi nerwami piszczelowymi, MG i LGS.
- Napełnij basen ciepłym (37 °C) olejem mineralnym.
- Umieść nerwy MG i LGS na bipolarnych elektrodach stymulujących srebrny drut i podłącz je do stymulatora impulsów kwadratowych. Używaj oddzielnych kanałów stymulacji dla każdego nerwu.
7. Umiejscowienie elektrody powierzchniowej
- Umieść srebrną elektrodę kulkową po lewej stronie ogonowej odsłoniętego rdzenia kręgowego, z elektrodą odniesienia włożoną w mięśnie pleców i podłącz obie elektrody do różnicowego wzmacniacza prądu stałego. Powierzchniowa elektroda kulowa będzie używana do rejestrowania aferentnych wolejów z nerwów.
- Za pomocą stymulatora prądu stałego stymuluj nerwy MG i LGS impulsami prostokątnymi o czasie trwania 0,1 ms, powtarzanymi z częstotliwością 3 Hz i obserwuj salwy aferentne.
- Określ próg (T) aktywacji nerwu, stymuluj każdy nerw o intensywności około 3·T i zapisz amplitudę salwy aferentnej dla każdego nerwu.
- Przesuń elektrodę powierzchniową rostralnie i powtórz procedurę, aby zidentyfikować segmenty kręgosłupa, przy których amplitudy salw są najwyższe dla każdego nerwu. Po określeniu maksymalnej lokalizacji salwy przesuń elektrodę powierzchniową na bezpieczną odległość od rdzenia kręgowego.
- Paraliż mięśni i tworzenie odmy opłucnowej w celu zmniejszenia ruchów oddechowych
- Sparaliżować szczura dożylnie blokerem nerwowo-mięśniowym i podłączyć rurkę dotchawiczą do zewnętrznego respiratora w linii z kapnometrem kompatybilnym z gryzoniami (bromek pankuronium, w dawce początkowej 0,4 mg·kg-1, uzupełniany co 30 minut w dawkach 0,2 mg·kg-1)
- Monitoruj stężenie CO2 w okresie końcowo-oddechowym i utrzymuj je na poziomie około 3–4%, dostosowując parametry wentylacji (częstotliwość, ciśnienie powietrza i objętości przepływu).
- Wykonaj podłużne nacięcie w skórze między 5. a 6. żebrem z boku nagrania.
- Używając nożyczek z końcówką, przetnij leżące nad nimi mięśnie, aby uwidocznić przestrzeń międzyżebrową między żebrami.
- Za pomocą małych, ostrych nożyczek wykonaj małe nacięcie w mięśniach międzyżebrowych i opłucnej, a następnie włóż końcówkę kleszczyków o krawędziach do otworu, uważając, aby nie naciskać na płuca.
- Pozwól, aby kleszcze się rozszerzyły lub włóż małą rurkę, aby odma opłucnowa była otwarta przez cały eksperyment.
- Po bloku nerwowo-mięśniowym monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając częstotliwość EKG i uzupełnij środek znieczulający, jeśli tętno przekracza 400 uderzeń na minutę. Paraliż mięśni i tworzenie odmy opłucnowej w celu zmniejszenia ruchów oddechowych, co poprawi stabilność nagrywania.
8. Otwieranie opony twardej i pia mater
- Za pomocą kleszczy #55 delikatnie podnieś oponę twardą i odetnij ją doogonowo od segmentu L5, rostralnie aż do segmentu L4.
- Za pomocą pary ultracienkich kleszczy 5SF wykonaj mały plaster w pia pokrywający kolumnę grzbietową między naczyniami krwionośnymi, dokładnie na poziomie maksymalnej salwy doprowadzającej z MG lub nerwu LGS.
- Użyj małych kawałków nasączonej solą fizjologiczną i wysuszonej pianki żelowej, aby w razie potrzeby zablokować krwawienie.
9. Umiejscowienie elektrody do przezrdzeniowej stymulacji prądem stałym (tsDCS)
- Wykonaj małe nacięcie w skórze po brzusznej stronie brzucha szczura na poziomie rostrocaudalnym odpowiadającym lokalizacji odcinków kręgosłupa lędźwiowego (L)4-L5.
- Chwyć odsłonięty płatek skóry metalowym klipsem, który posłuży jako elektroda odniesienia.
- Umieść gąbkę nasączoną solą fizjologiczną na grzbietowej stronie kręgu piersiowego (Th) 12. Upewnij się, że rozmiar gąbki jest równy rozmiarowi aktywnej elektrody tsDCS (płyta ze stali nierdzewnej w kształcie koła o średnicy 5 mm).
- Za pomocą precyzyjnego manipulatora dociśnij gąbkę z aktywną elektrodą tsDCS do kości i upewnij się, że cała powierzchnia elektrody jest równomiernie dociśnięta.
- Podłącz referencyjne i aktywne elektrody tsDCS do stymulatora prądu stałego, który jest w stanie zapewnić ciągły przepływ prądu stałego.
10. Przygotowanie mikropipet
- Za pomocą ściągacza do mikroelektrod przygotuj mikroelektrodę.
nuta: Można stosować zarówno elektrody filamentowe, jak i bezfilamentowe. Pamiętaj jednak, że trzon elektrody musi być na tyle długi, aby dotrzeć do rogu brzusznego, a jednocześnie być na tyle cienki, aby nie uciskać rdzenia kręgowego podczas schodzenia.
- Wyreguluj ustawienie ściągacza tak, aby trzpień wchodzący do rdzenia kręgowego miał około 3 mm długości, podczas gdy końcówka elektrody miała średnicę nie większą niż 1\u20122 μm, a rezystancja mikroelektrody wynosiła od 10 do 20 MΩ.
- Napełnij mikroelektrody elektrolitem cytrynianu potasu 2M.
- Zamontuj przygotowaną mikroelektrodę na mikromanipulatorze, umożliwiając ruch krokowy 1\u20122 μm i kalibrację stereotaktyczną.
- Połącz mikroelektrodę ze wzmacniaczem wewnątrzkomórkowym z elektrodą referencyjną umieszczoną w mięśniach pleców.
- Po bloku nerwowo-mięśniowym monitoruj głębokość znieczulenia, sprawdzając częstotliwość elektrokardiogramu (EKG) i uzupełnij środek znieczulający, aby tętno szczura nie przekraczało 400 uderzeń na minutę.
11. Śledzenie i penetracja motoneuronów
- Umieść elektrodę rejestrującą salwę aferentną z powrotem na grzbietowej powierzchni rdzenia kręgowego, doogonowo do miejsca rejestracji, na poziomie segmentu L6.
- Stymuluj nerw brzuchaty łydki przyśrodkowego (MG) oraz nerw brzuchaty łydki i płaszczkowatego boczny (LGS) impulsami elektrycznymi 0,1 ms o częstotliwości 3 Hz i intensywności 3T, aby aktywować wszystkie aksony alfa-motoneuronów w wybranym nerwie.
- Wbić mikropipetę w wybrany plaster w pia o kącie środkowo-bocznym 15\u201220° (z końcówką skierowaną na bok).
- Po zejściu pod powierzchnię należy skalibrować mikroelektrodę i skompensować jej pojemność oraz przesunięcie napięcia, a następnie kontynuować penetrację rdzenia kręgowego, gdy wszystkie parametry są stabilne. Potencjał pola antydromicznego puli motoneuronów będzie widoczny na śladzie napięcia mikroelektrody podczas zbliżania się do dedykowanego jądra ruchowego podczas stymulacji odpowiedniego nerwu.
- Kontynuuj penetrację mikroelektrodą w krokach co 1\u20122 μm i okresowo używaj funkcji brzęczenia wzmacniacza wewnątrzkomórkowego, aby oczyścić końcówkę elektrody z wszelkich pozostałości.
- Obserwuj penetrację neuronów ruchowych, która będzie charakteryzować się nagłą hiperpolaryzacją zarejestrowanego śladu napięcia i pojawieniem się antydromicznego potencjału skokowego.
12. Rejestrowanie właściwości błony neuronu ruchowego i wypalania
- W trybie mostkowym wzmacniacza wewnątrzkomórkowego zidentyfikuj motoneuron na podstawie wyglądu "wszystko albo nic" antydromicznego potencjału czynnościowego poprzez stymulację odpowiednich gałęzi nerwowych. Zapisać 20 kolejnych śladów w celu późniejszego uśrednienia.
- Wdrożenie ścisłego kryterium włączenia w celu zapewnienia wysokiej jakości danych: potencjał spoczynkowy błony o amplitudzie co najmniej -50 mV; amplituda potencjału czynnościowego większa niż 50 mV, z dodatnim przeregulowaniem; potencjał błonowy stabilny przez co najmniej 5 minut przed rejestracją.
- W nieciągłym trybie cęgowym prądu (tryb przełączania prądu 4–8 kHz) wzmacniacza wewnątrzkomórkowego wywołaj ortodromiczny potencjał czynnościowy w motoneuronie za pomocą wewnątrzkomórkowych impulsów prądu depolaryzującego 0,5 ms. Powtórz te czynności co najmniej 20 razy, aby uśrednić w trybie offline.
- Stymuluj motoneuron za pomocą 40 krótkich impulsów (100 ms) prądu hiperpolaryzacyjnego (1 nA) w celu obliczenia rezystancji wejściowej komórki.
- Stymuluj motoneuron impulsami fali prostokątnej o długości 50 ms o rosnących amplitudach, aby określić wartość reozasady jako minimalną amplitudę prądu depolaryzacyjnego wymaganą do wywołania pojedynczego skoku.
- Wstrzyknij impulsy fali prostokątnej o długości 500 ms prądu depolaryzującego o rosnących amplitudach w krokach co 0,1–2 nA, aby wywołać rytmiczne wyładowania neuronów ruchowych.
13. Przezrdzeniowa stymulacja prądem stałym (tsDCS)
- Utrzymując stabilną penetrację neuronu ruchowego, rozpocznij procedurę polaryzacji poprzez przezrdzeniowe zastosowanie prądu stałego. Dostosuj aktualną intensywność i czas aplikacji do projektu eksperymentu (np. 0,1 mA przez 15 min).
- Natychmiast po włączeniu prądu stałego obserwuj potencjał błony neuronu ruchowego. Polaryzacja anodowa (elektroda czynna jako anoda) powinna powodować depolaryzację potencjału błony, natomiast polaryzacja katodowa (elektroda aktywna jako katoda) powinna wywołać odwrotny efekt. Obserwuj, czy zmiana spoczynkowego potencjału błony w odpowiedzi na stymulację prądem stałym jest stała, co zapewnia, że natężenie pola elektrycznego nie jest zakłócone.
- Podczas aplikacji prądu ciągłego powtarzaj kroki 5.3\u20125.6 w odstępach 5-minutowych.
- Wyłącz kontroler domeny i kontynuuj powtarzanie kroków 5.3–5.6 w odstępach 5-minutowych, aż nagrania staną się niestabilne lub kryteria włączenia zostaną naruszone.
- Zakończyć eksperyment i poddać zwierzę eutanazji poprzez dożylne podanie śmiertelnej dawki pentobarbitalu sodu (180 mg·kg-1).
awy Sp. z o.o