Zastosowanie prądów szumowych do neuronów przyśrodkowego jądra przedsionkowego przy użyciu techniki patch-clamp dla całych komórek

Streszczenie

Źródło: Stefani, S. P., et al. Aplikacja szumu stochastycznego do oceny wrażliwości neuronów jądra przedsionkowego przyśrodkowego in vitro. J. Vis. Exp. (2019).

Ten film demonstruje protokół polegający na zastosowaniu podprogowych prądów szumu do neuronów jądra przedsionkowego przyśrodkowego za pomocą techniki patch-clamp dla całej komórki w celu zbadania wpływu prądów szumu na wrażliwość neuronów na bodźce elektryczne.

Protokół

Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.

1. Zwierzęta

UWAGA: Myszy uzyskano z Australijskiego Centrum Gryzoni (ARC; Perth, Australia) i odbyło się w Medical Foundation Building Animal Facility na Uniwersytecie w Sydney.

1. Utrzymuj myszy w standardowym 12-godzinnym cyklu światło/ciemność ze wzbogaceniem środowiska.
2. Do wszystkich eksperymentów należy używać samców i samic myszy C57BL/6 (w wieku 3–5 tygodni).

2. Przygotowanie roztworów

1. Przygotuj 1 l sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) składającego się z 29 mM NaHCO₃, 11 mM glukozy, 120 mM NaCl, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂.
2. Przygotować 200 ml sacharozy-ACSF (sACSF) zawierającej 29 mM NaHCO₃, 11 mM glukozy, 241,5 mM sacharozy, 3,3 mM KCl, 1,4 mM NaH₂PO₄, 2,2 mM MgCl₂, 2,77 mM CaCl₂. Przed dodaniem CaCl₂ do ACSF i sACSF należy zagazować roztwory karbogenem (95 %_O2 i 5 % CO_{2 ),} aby uzyskać pH 7,4 i uniknąć wytrącania się wapnia (zmętnienia).
3. Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy na bazie K⁺ składający się z 70 mM glukonianu potasu, 70 mM KCl, 2 mM NaCl, 10 mM HEPES, 4 mM EGTA, 4 mM Mg_2-ATP, 0,3 mM Na_3-GTP, o końcowym pH 7,3 (skorygowanym za pomocą KOH).
   nuta: Zaleca się, aby roztwory wewnątrzkomórkowe były filtrowane filtrami 0,22 μm i przechowywane w podwielokrotnościach o pojemności 0,5 ml w temperaturze -20 °C.

3. Przygotowanie pnia mózgu

1. Przed ekstrakcją pnia mózgu należy zrównoważyć sACSF z karbogenem i schłodzić w temperaturze -80 °C przez 25 minut, aby utworzyć zawiesinę lodu.
2. Znieczulić mysz izofluranem (3–5%) nasyconym tlenem (3 ml/min). Gdy odruchy tylnej łapy znikną, odetnij głowę myszy ostrymi nożyczkami ze stali nierdzewnej.
3. Odsłoń czaszkę, wykonując strzałkowe nacięcie w skórze za pomocą żyletki (#22 zaokrąglone).
4. Używając spiczastego końca nożyczek o standardowym wzorze, wykonaj małe nacięcie w lambda i przetnij wzdłuż podłużnej szczeliny.
5. Ostrożnie odbij sparowane kości ciemieniowe i potyliczne za pomocą pary płytko zgiętych rongeurów Pearsona.
   nuta: Podczas tej procedury mózg jest stale kąpany in situ przy użyciu wcześniej przygotowanej lodowatej zawiesiny sACSF.
6. Odizoluj pień mózgu od przodomózgowia i jego kostnej osłony za pomocą żyletki (#11 prosto), aby wyciąć bruzdę ciemieniowo-potyliczną i rdzeń ogonowy.
7. Zamontuj izolowany brzuszny koniec pnia mózgu na wcześniej przyciętym trapezowym bloku polistyrenowym. Użyj z bibuły, aby usunąć nadmiar płynu wokół wypreparowanej tkanki i zapewnić dobrą przyczepność tkanki do etapu cięcia.
   nuta: Blok polistyrenu jest wycięty w kształcie trapezu, aby zapewnić, że rostralny koniec śródmózgowia pasuje i zwęża się do rdzenia kręgowego.
8. Użyj kleju cyjanoakrylowego, aby przymocować blok polistyrenu z dołączonym końcem rostralnym pnia mózgu do etapu cięcia.
9. Wykorzystując prędkość posuwu 0,16 mm/s i amplitudę drgań 3,00 mm, przygotuj 200 μm poprzeczne warstwy MVN.
   nuta: Lokalizacja MVN jest określana za pomocą atlasu mózgu myszy Paxinos i Franklina. MVN (wymieniony w atlasie jako MVe) leży bezpośrednio brzuszno-bocznie do 4. komory i jest największy tuż przed przyczepem móżdżku (między wzgórkiem dolnym a zasuwką).
10. Za pomocą pipety z tworzywa sztucznego przenieś plastry na krążek z bibuły filtracyjnej umieszczony w karbogenicznym ACSF w temperaturze 25 °C przez co najmniej 30 minut przed nagraniem.

4. Instrumenty

1. Użyj standardowej konfiguracji elektrofizjologicznej, aby wykonać technikę zacisku krosowego dla całej komórki.
2. Przygotować mikropipety zgodnie z dwuetapowym protokołem (krok podgrzewania 1: 70; krok podgrzewania 2: 45) na ściągaczu do mikropipet (patrz tabela materiałów).
3. Po umieszczeniu w kąpieli mikropipety powinny mieć rezystancję końcową w zakresie od 3 do 5 MΩ z roztworem wewnętrznym.
   nuta: Używane ustawienia mogą się różnić w zależności od temperatury w pomieszczeniu i mogą się dość często zmieniać.

5. Elektrofizjologia zacisku krosowego dla całych komórek

1. Aby uzyskać zapisy klamry krosowej całej komórki z pojedynczych neuronów w MVN, w pipecie rejestrującej stosuje się wewnętrzne rozwiązanie oparte na K+.
2. Przenieść pojedynczy plaster tkanki z komory inkubacyjnej do komory rejestracyjnej i zabezpieczyć go nylonową nicią na ciężarku w kształcie litery U. Stale napełniać komorę rejestracyjną karbogenicznym ACSF w temperaturze 25 °C przy natężeniu przepływu 3 ml/min.
3. Po napełnieniu mikropipety roztworem wewnętrznym zlokalizuj MVN za pomocą soczewki obiektywu o małej mocy (10x). Korzystając z obiektywu o dużej mocy (40x), można zlokalizować poszczególne neurony w MVN.
   nuta: Jakość ogniwa ma zasadnicze znaczenie dla zapewnienia jakości nagrań i trwałości ogniwa podczas próby uzyskania konfiguracji całego ogniwa. Odpowiednia komórka będzie wykazywać kulisty kształt, odblaskową błonę komórkową i niewidoczne jądro. Nieodpowiednia komórka będzie miała duże widoczne jądro (podobne do jaja) i spuchnięty/skurczony wygląd.
4. Przed naruszeniem tkanki pipetą należy zastosować niewielki nadciśnienie, aby odepchnąć zanieczyszczenia od końcówki pipety.
5. Przesuń pipetę za pomocą mikromanipulatora w kierunku wybranego neuronu, a na błonie neuronalnej powinien powstać mały wgłębienie.
   Zwolnij nadciśnienie i zastosuj niewielką ilość podciśnienia.
6. Po uzyskaniu uszczelnienia 1 GΩ należy zastosować delikatne, krótkie i ostre podciśnienie do uchwytu pipety przez port ssący, aby rozerwać membranę i utworzyć konfigurację całej komórki.
7. Wykonuj nagrania cęgów prądowych całych ogniw przy użyciu standardowych technik.

6. Zastosowanie szumu sinusoidalnego i stochastycznego do poszczególnych neuronów jądra przedsionkowego przyśrodkowego

1. Zastosuj szum stochastyczny i sinusoidalny w zakresie amplitud od 3 do 24 pA, aby określić próg neuronalny i szybkość wypalania.
2. Określ próg sensoryczny, grupując niższe i wyższe intensywności bodźców i wykonaj ANOVA, aby zaobserwować wszelkie różnice (jak pokazano na rysunku 1).
3. Oblicz średnią szybkość wypalania w okresie 10 sekund, w którym krok prądu depolaryzującego był/będzie wstrzykiwany dla każdego indywidualnego poziomu prądu (tj. łącznie 7 epizodów; Rysunek 2).
4. Użyj średnich wartości szybkości wypalania, aby wygenerować szybkość wypalania w stosunku do bieżącego wykresu i wykonaj analizę regresji liniowej, aby określić nachylenie linii najlepszego dopasowania. Gradient najlepiej dopasowanej linii wskazuje na przyrost neuronów.

Wyniki

Rysunek 1: Obiektywne określenie progu 12 pA. Szybkości wyzwalania dla mniej niż 12 pA (3 i 6 pA) i więcej niż 12 pA (18 i 24 pA) zostały zebrane i uśrednione. Średnie te zostały następnie przeanalizowane przy użyciu ANOVA i istotności statystycznej między pozorem a >12 pA oraz między <12 pA a >12 pA. *p < 0,05.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CaCl2	Scharlau	CA01951000	Używany do ACSF i sACSF
D-(+)-glukoza	Sigma	Kontroler G8270	Używany do ACSF i sACSF
EGTA (EGTA)	Sigma	E0396-25G	Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K
HEPESY	Sigma	Zobacz materiał H3375-25G	Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K
Kcl	Zaopatrzenie w chem-supply	PA054-500G	Stosowany do ACSF, sACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego
K-glukonian	Sigma	Zobacz materiał P1847-100G	Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K
Mg-ATP (Mg-ATP)	Sigma	A9187-500MG	Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K
MgCl	Zaopatrzenie w chem-supply	MA00360500	Używany do ACSF i sACSF
Na3-GTP	Sigma	G8877-100MG	Używany do roztworu wewnątrzkomórkowego na bazie K
Zawartość NaCl	Zaopatrzenie w chem-supply	SO02270500	Stosować do ACSF i roztworu wewnątrzkomórkowego
NaH2PO4.2H 2O	Ajax	AJA471-500G	Używany do ACSF i sACSF
NaHCO3	Sigma	S5761-1KG	Używany do ACSF i sACSF
sacharoza	Zaopatrzenie w chem-supply	SA030-500G	Używany do sACSF
Izofluran	Henryk Schein	1169567762	Służy do znieczulania myszy
sprzęt
Kapilary ze szkła borokrzemianowego	Instrumenty Warnera	GC150T-7.5	1,5 mm średnica zewnętrzna, średnica wewnętrzna 1,16 mm, 7,5 cm długość
Oprogramowanie do akwizycji danych	Aksograf		Używany do elektrofizjologii i analizy
Friedmen-Pearson Rongeurs	Światowe instrumenty precyzyjne	Numer katalogowy: 14089	Służy do preparacji
Ściągacz do mikropipet	Narishige powiedział:	Zobacz materiał PP-830	Używany do mikropipet
Wzmacniacz wielozaciskowy	Instrumenty firmy Axon	700 mld	Używany do elektrofizjologii
pH-metr	Sper naukowy	860033	Używany do rozwiązania wewnętrznego
Nożyczki o standardowym wzorze	Certyfikat FST	Numer katalogowy 14028-10	Służy do preparacji
Mikromanipulator Suttera	Sutter	Szybkostrzelny silnik MP-225/M	Używany do elektrofizjologii
Mikroskop pionowy	Olympus	BX51WI	Używany do elektrofizjologii
Wibratomizm	Księga Leica	Zobacz materiał VT1200	Służy do krojenia tkanki mózgowej