Wykrywanie poziomu nadtlenku wodoru w hodowanych neuronach za pomocą obrazowania fluorescencyjnego żywych komórek

Streszczenie

Źródło: Terzi, A. et al., ROS Live Cell Imaging during Neuronal Development.J. Vis. Exp. (2021).

Ten film demonstruje technikę wykrywania poziomów nadtlenku wodoru w czasie rzeczywistym w komórkach zwojowych siatkówki za pomocą biosensora roGFP2-Orp1 i technik obrazowania żywych komórek. Przedstawia etapy związane z przygotowaniem komórek, obrazowaniem fluorescencyjnym i ilościowym oznaczaniem poziomów nadtlenku wodoru.

Protokół

1. Obrazowanie in vitro reaktywnych form tlenu (ROS) hodowanych neuronów komórek zwojowych siatkówki (RGC)

1. W dniu obrazowania (zwykle 6-24 godziny po posiewie komórek) sprawdź komórki zwojowe siatkówki pod mikroskopem, aby potwierdzić wzrost aksonów RGC.
2. W przypadku obrazowania żywych komórek przenieś szkiełka nakrywkowe z szalki hodowlanej do komory obrazowania żywych komórek.
3. Skonfiguruj mikroskop do obrazowania. Użyj odwróconego mikroskopu wyposażonego w obiektyw z kontrastem różnicowym interferencyjnym (DIC), długoprzepustowy filtr czerwony OG590 i kamerę EM-CCD.
4. Przed obrazowaniem należy zastąpić pożywkę do hodowli komórek danio pręgowanego surowicą i antybiotykami (ZFCM)(+)) pożywką do hodowli komórek danio pręgowanego bez surowicy i antybiotyków (ZFCM(-)).
5. Po ustawieniu komórek z 10-krotnym obiektywem uzyskuj obrazy w 60-krotnym powiększeniu za pomocą obiektywu immersyjnego z olejkiem o wysokiej NA. Użyj dodatkowego powiększenia 1,5x.
6. Najpierw uzyskaj obrazy DIC. Następnie należy zobrazować roGFP2-Orp1 za pomocą odpowiedniego zestawu filtrów. Wzbudz roGFP2-Orp1 z filtrami wzbudzenia 405/20 i 480/30 nm sekwencyjnie i uzyskaj obrazy za pomocą filtra emisyjnego 535/30 nm po przejściu światła emisyjnego przez zwierciadło dichroiczne 505DCXR.
7. Po wykonaniu pierwszego zestawu obrazów należy wymienić pożywkę na pożywkę zawierającą różne roztwory do obróbki. Pożywkę należy wymieniać co 30 minut obrazowania, aby uniknąć zmian pH i osmolarności.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Naczynie hodowlane 35 mm	Sarstedt	Numer katalogowy: 83-3900
Szkło nakrywkowe	Corning	2850-22
Jednorazowe szalki Petriego (100 x 15 mm)	Firma VWR	Numer katalogowy: 25384-094
Surowica bydlęca płodu	ThermoFisher Naukowy	26140087
Mikroskop odwrócony	Nikon	Pakiet TE2000
Laminina	ThermoFisher Naukowy	23017-015
Leibovitz's L-15 Medium z czerwienią fenolową	Gibco/Fisher Scientific	11-415-064
Leibovitz's L-15 Medium bez czerwieni fenolowej	Gibco/Fisher Scientific	21-083-027
Penicylina/streptomycyna	ThermoFisher Naukowy	15140122
Czerwień fenolowa	Sigma Aldich	Zobacz materiał P0290
Poli-D-lizyna (PDL)	Sigma Aldich	Zobacz materiał P7280
Filtr Steritop 0,22 μm	Milipory	S2GPT05RE
Chlorek wapnia dwuwodny	Fisher Naukowy	Zobacz materiał C79-500
glukoza	Sigma Aldrich	Zobacz materiał G7528
HEPESY	Sigma Aldrich	Zobacz materiał H4034

powiedział: