Ustalenie konfiguracji całej komórki do dwufotonowego obrazowania wapnia wycinków mózgu

Streszczenie

Źródło: Camiré, O., et al. Dwufotonowe obrazowanie wapnia w dendrytach neuronalnych w wycinkach mózgu. J. Vis. Exp. (2018).

Ten film demonstruje protokół rejestracji całej komórki i dwufotonowego obrazowania wapnia w wycinkach hipokampa mózgu. Metoda ta pozwala na badanie dynamiki lokalnych stanów przejściowych^Ca2+ (CaT) w dendrytach różnych typów neuronów w ostrych wycinkach mózgu.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiedni przegląd etyczny zwierząt.

1. Wstępne przygotowanie (opcjonalnie: przygotuj 1 dzień wcześniej)

1. Przygotować trzy rodzaje roztworów sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) (roztwór normalny, sacharoza i roztwór regeneracyjny, po 1 l każdy; patrz Tabela 1). Dostosować osmolalność roztworów do 300 ± 10 mOsm i schłodzić sacharozę ACSF do temperatury bliskiej zeru (0-4 °C).
   nuta: Zastosowanie roztworu tnącego o niskiej zawartości sodu (ACSF-sacharoza) pomaga zachować żywotność neuronów w powierzchownych warstwach ostrych plastrów.
2. Przygotować 0,75 ml roztworu zawierającego czerwony fluorofor (np. Alexa-594) i zielony syntetyczny wskaźnik wapnia (np. Oregon Green BAPTA-1; patrz Tabela 1). Włączyć biocytynę (patrz Tabela 1) do roztworu plastru, jeśli wymagana jest morfologiczna identyfikacja post hoc zarejestrowanych komórek.
3. Dostosuj osmolalność roztworu do 280 ± 5 mOsm i pH do 7,35 ± 0,5. Roztwór należy przechowywać w lodówce lub na lodzie przez cały czas.
   nuta: Wybór wskaźnika wapnia powinien opierać się na jego zakresie dynamicznym oraz na charakterze badanych zdarzeń Ca²⁺.
4. Za pomocą ściągacza do mikropipet przygotować pipety punktowe z kapilar ze szkła borokrzemianowego (patrz tabela materiałów) z końcówką ≈ 2 μm (rezystancja pipet 3-5 MΩ) oraz pipety stymulacyjne z kapilar ze szkła borokrzemianowego theta (patrz tabela materiałów) z końcówką 2-5 μm.
   nuta: Ustawienia ściągacza do wykonywania pipet o danej średnicy i kształcie będą zależały od typu filamentu ściągacza oraz wyników testu rampy dla danego rodzaju szkła.

2. Nagrania z użyciem clampów krosowych dla całej komórki

1. Umieść wycinek hipokampa w wannie umieszczonej pod obiektywem (powiększenie: 40x, apertura numeryczna: 0,8) laserowego mikroskopu dwufotonowego. Łaźnię należy w sposób ciągły przetapiać natleniznym ACSF-Normal podgrzanym w temperaturze 30-32 °C z szybkością 2,5-3 ml/min.
2. Użyj kontrastu różnicowego interferencji w podczerwieni (IR-DIC) lub mikroskopii Dodt-SGC, aby zlokalizować komórkę zainteresowania na podstawie jej rozmiaru, kształtu i położenia.
   nuta: W zależności od docelowej populacji neuronów, transgeniczny model myszy może być użyty do łatwego zlokalizowania interesujących komórek. W takim przypadku krok ten można zastąpić użyciem fluorescencyjnego źródła światła.
3. Napełnij pipetę stymulacyjną roztworem ACSF-Normal zawierającym czerwony fluorofor (np. Alexa-594).
4. Umieść pipetę stymulacyjną (podłączoną do jednostki stymulacji elektrycznej) na wierzchu plastra tak, aby końcówka znajdowała się w tym samym obszarze, co komórka będąca przedmiotem zainteresowania.
5. Po napełnieniu pipety z plastrem roztworem plastra i przymocowaniu jej do stopnia głównego, umieść ją nad plasterkiem tak, aby jej końcówka znajdowała się bezpośrednio nad komórką będącą przedmiotem zainteresowania.
6. Włożyć strzykawkę do trójdrożnego kranu i podłączyć ją do pipety krosowej przez plastikową rurkę. Wstrzykiwać stałe nadciśnienie do pipety z plastrem (≈ 0,1 ml) za pomocą strzykawki. Utrzymuj kran w pozycji "zamkniętej".
7. Aktywuj moduł oprogramowania sterującego wzmacniacza i przełącz na tryb napięcia clamp, klikając przycisk "VC". Otwórz oprogramowanie do gromadzenia danych elektrofizjologicznych (np. clampex) do zbierania sygnałów elektrofizjologicznych i kliknij ikonę "Test membranowy", aby w sposób ciągły wysyłał impuls napięcia kwadratowego (5 mV, 10 ms), który jest niezbędny do monitorowania zmian oporu pipety.
8. Opuścić pipetę z plastrem, aż znajdzie się na wierzchu docelowej komórki. Po zetknięciu się z błoną komórkową należy usunąć ciśnienie, przekręcając kran do pozycji "otwartej".
   nuta: Kontakt z błoną komórkową jest wykrywany, gdy obserwuje się niewielki wzrost oporu pipety (≈ 0,2 MΩ), a niewielkie wgłębienie na ogniwie jest spowodowane dodatnim ciśnieniem.
9. Za pomocą pustej strzykawki włożonej w kran należy zastosować lekkie podciśnienie do pipety z plastrem, aż opór pipety dostarczony przez oprogramowanie osiągnie 1 GΩ. W oknie "Membrane Test" oprogramowania do akwizycji danych zaciśnij ogniwo pod napięciem -60 mV.
10. Kontynuuj stosowanie podciśnienia, aż ogniwo zostanie otwarte i zostanie osiągnięta konfiguracja całego ogniwa. Wykrywanie tego stanu komórek opiera się na nagłej zmianie rezystancji pipety (od 1 GΩ do 70-500 MΩ w zależności od typu interneuronu) oraz pojawieniu się dużych pojemnościowych stanów przejściowych w oknie "Membrane Test".

3. Wapń dwufotonowy (Ca²⁺)Obrazowanie

1. Jeśli interesują Cię pobudzające odpowiedzi postsynaptyczne, dodaj bloker receptora GABAA gabazynę (10 μM) i bloker receptora GABAB CGP55845 (2 μM) do kąpieli ACSF.
2. W module oprogramowania sterującego wzmacniaczem ustaw konfigurację patcha na current-clamp klikając przycisk "CC" i zapisz schemat wyzwalania ogniwa w odpowiedzi na somatyczne wstrzyknięcia prądu depolaryzującego (0,8-1,0 nA, 1 s). Odczekaj co najmniej 30 minut, aż komora zostanie wypełniona wskaźnikami obecnymi w roztworze plastrowym.
   nuta: Wzorzec wypalania komórki i właściwości aktywne mogą być wykorzystane do identyfikacji jej podtypu, np. komórek szybko rosnących. Ważne jest, aby stężenie wskaźnikowe ustabilizowało się poprzez dyfuzję przed rozpoczęciem rejestrowania stanów przejściowych wapnia (CaT) (patrz Tabela 2 w celu rozwiązywania problemów).
3. CaTs wywołane przez AP
   1. Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazów, rozpocznij pobieranie obrazów. Zlokalizuj interesujący Cię dendryt za pomocą czerwonego sygnału fluorescencji. Aby zapewnić widoczną odpowiedź, najpierw wybierz dendryt proksymalny (≤ 50 μm), ponieważ skuteczność wstecznej propagacji AP może znacznie spadać wraz z odległością w interneuronach GABA-ergicznych.
   2. Korzystając z "narzędzia prostokątnego" w oprogramowaniu do akwizycji obrazu, powiększ docelowy obszar i przełącz się w tryb "xt" (linecan). Umieść skan w poprzek interesującej Cię gałęzi dendrytycznej. Za pomocą regulatorów intensywności lasera w oprogramowaniu do akwizycji, ustaw laser dwufotonowy na minimalny poziom mocy, gdzie podstawowa zielona fluorescencja jest tylko nieznacznie widoczna, aby uniknąć fototoksyczności.
   3. W oknie "Protokół" oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych i oprogramowaniu do akwizycji obrazu utwórz próbę zapisu o żądanym czasie trwania, zawierającą wstrzyknięcie prądu somatycznego o pożądanej amplitudzie.
      1. Korzystając z oprogramowania do akwizycji obrazu, kliknij przycisk "Rozpocznij nagrywanie" i uzyskaj fluorescencję w sposób ciągły przez 1-2 s. Powtórz akwizycję obrazu 3-10 razy. Odczekaj co najmniej 30 sekund między pojedynczymi skanami, aby uniknąć fotouszkodzenia. Jeśli zdobywasz linie w wielu punktach wzdłuż dendrytu, weź je w losowej kolejności, aby uniknąć efektów kolejności.
4. Synaptyczne CaTy wywołane
   1. Zlokalizuj interesujący Cię dendryt za pomocą czerwonego sygnału fluorescencji.
   2. Umieść pipetę stymulacyjną na powierzchni plastra powyżej interesującego nas dendrytu. Powoli opuść pipetę stymulacyjną na miejsce, minimalizując ruch, aby uniknąć zakłócenia konfiguracji całej komórki. Ustawić pipetę w odległości 10-15 μm od dendrytu.
   3. Aby zobrazować lokalizację mikrodomen synaptycznych w dendrytach aspinycznych, w oprogramowaniu do akwizycji obrazu przełącz się w tryb "xt" (linescan) i ustaw linię wzdłuż interesującej nas gałęzi dendrytycznej.
   4. W oknie "Protokół" (oprogramowania do akwizycji danych elektrofizjologicznych) i oprogramowaniu do akwizycji obrazu utwórz próbę rejestracyjną, która uruchamia jednostkę stymulacji po rozpoczęciu badania.
   5. Korzystając z oprogramowania do akwizycji, kliknij przycisk "Rozpocznij nagrywanie", aby skanować wzdłuż dendrytu w sposób ciągły przez 1-2 s. Powtórz akwizycję 3-5 razy, czekając 30 s między skanami, aby zapobiec fotouszkodzeniu.
      nuta: Długość skanowania można dostosować w zależności od kinetyki wywołanego zdarzenia, ale należy ją zminimalizować, aby zapobiec fotouszkodzeniom (patrz Tabela 2 w celu rozwiązywania problemów).
   6. Powtórzyć krok 3.4.5 w różnych warunkach (np. różna intensywność/czas trwania stymulacji, wprowadzenie farmakologicznego blokera itp.) w zależności od konkretnego pytania, na które się odpowiada.
   7. Przerwij akwizycję, gdy komórka wykazuje oznaki pogarszającego się stanu zdrowia: depolaryzacja poniżej -45 mV, wzrost wyjściowego poziomu Ca²⁺, morfologiczne pogorszenie dendrytów (np. pęcherzyki, fragmentacja; patrz Tabela 2 w celu rozwiązywania problemów).
   8. Aby uzyskać wstępne informacje na temat morfologii komórki i prowadzić rejestr lokalizacji pipety stymulacyjnej, należy uzyskać stos Z komórki w kanale czerwonym. Korzystając z oprogramowania do akwizycji w trybie "xyz", ustaw górny i dolny limit stosu, aby zobrazować całą komórkę ze wszystkimi uwzględnionymi procesami. Ustaw "rozmiar kroku" na 1 μm i rozpocznij akwizycję stosu za pomocą przycisku "Rozpocznij nagrywanie".
   9. Po zakończeniu akwizycji stosu Z użyj opcji "Maksymalna projekcja" w oprogramowaniu, aby nałożyć wszystkie plany ogniskowe stosu i zweryfikować jakość akwizycji. Następnie powoli wyjmij pipetę z plastrem z plastrem.
   10. Aby utrwalić plasterek w celu identyfikacji morfologicznej post hoc, szybko wyjmij plaster z kąpieli za pomocą płaskiego pędzla i umieść go między dwiema bibułami filtracyjnymi na szalce Petriego wypełnionej ACSF. Zastąp ACSF 4% roztworem paraformaldehydu (PFA) i pozostaw naczynie na noc w pomieszczeniu lub lodówce o temperaturze 4 °C.

Tabela 1: Przepisy na rozwiązania. Związki i stężenia roztworów stosowanych podczas protokołu.

Rozdział powiedział: powiedział: powiedział: Rozdział powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: szt. powiedział: pkt. pkt. pkt.

rozwiązanie	składnik	Stężenie (mM)
ACSF-Normalny	Zawartość NaCl	124
	Kcl	Rozdział 2.5
	NaH2PO4	Wydanie orzeczenia 1,25
	MgSO4	cyfra arabska
	NaHCO3	26
	glukoza	10
	CaCl2	cyfra arabska
Odzyskiwanie ACSF	Zawartość NaCl	124
	Kcl	Rozdział 2.5
	NaH2PO4	Wydanie orzeczenia 1,25
	MgSO4	3
	NaHCO3	26
	glukoza	10
	CaCl2	1
ACSF-Sacharoza	Kcl	cyfra arabska
	NaH2PO4	Wydanie orzeczenia 1,25
	MgSO4	7
	NaHCO3	26
	glukoza	10
	sacharoza	Rozdział 219
	CaCl2	1
K+ oparte na rozwiązaniu Patch	K+-glukonian	130
	HEPESY	10
	MgCl2	cyfra arabska
	Di(tris)sól fosfokreatyny	10
	ATP-Tris (Protokół ATP-Tris)	cyfra arabska
	GTP-Tris (Galaktyka GTP-Tris)	0,2
	Biocytyna	72 Rozdział 72
	Alexa-594 (wersja angielska)	0,02
	Oregon Zielony-BAPTA-1	0,2

Tabela 2: Tabela rozwiązywania problemów. Rozwiązania typowych problemów, które mogą wystąpić podczas eksperymentu z obrazowaniem Ca²⁺.

.

problem	rozwiązanie
Nie można załatać zdrowego neuronu	Sprawdź, czy nie ma oznak niezdrowych plasterków: skurczone lub spuchnięte komórki, widoczne jądra itp. Jeśli tak, wyrzuć plasterki. Należy również sprawdzić rezystancję pipety plastra i osmolalność roztworu plastra; Zastąp je, jeśli wartości nie mieszczą się w odpowiednim zakresie.
Sygnał fluorescencji z dendrytów jest niski	Poczekaj dłużej, aż komórka się wypełni. Jeśli przeszkoda uniemożliwia dyfuzję roztworu plastra do komórki, spróbuj zastosować niewielką ilość podciśnienia w pipecie plastrowej.
Stymulacja elektryczna nie wywołuje odpowiedzi Ca2+	Sprawdź, czy w zapisie elektrofizjologicznym znajduje się artefakt. Jeśli nie ma go w pobliżu, sprawdź, czy nie ma awarii jednostki zwarciowej/stymulującej. Jeśli jest obecny, zwiększ intensywność stymulacji lub przesuń pipetę stymulacji bliżej dendrytu. Należy zauważyć, że odległość między elektrodą stymulacyjną a dendrytem nie powinna przekraczać 8 μm, aby zapobiec bezpośredniej depolaryzacji dendrytów podczas badania odpowiedzi synaptycznych.
Wywołany sygnał Ca2+ jest zbyt wysoki/nasyca wskaźnik Ca2+	Zmniejsz moc lasera. Jeśli problem będzie się powtarzał w wielu komórkach, użyj innego wskaźnika Ca2+ o niższym powinowactwie Ca2+.
Podstawowy sygnał Ca2+ stopniowo wzrasta podczas eksperymentu	Poczekaj dłuższy czas między poszczególnymi skanowaniami. Jeśli wartość bazowa nadal rośnie, zatrzymaj akwizycję; Oznacza to, że zdrowie komórki prawdopodobnie się pogarsza
Amplituda sygnału Ca2+ zmniejsza się podczas skanowania	Zmniejsz moc lasera lub pomniejsz (jeśli dotyczy).
Dendryt ulega fragmentacji ("pęcherzykowi") po zeskanowaniu	Zmniejsz moc lasera lub pomniejsz. Jeśli pęcherzyki są ograniczone do docelowego dendrytu, wybierz inny dendryt i zmniejsz moc lasera / pomniejszanie. Jeśli wiele dendrytów bulgocze, przerwij akwizycję.
Sygnały fluorescencyjne "dryfują" poza linię skanowania po przemiataniu	Zmniejsz ruch w plasterku, zmniejszając prędkość perfuzji ACSF. Przed łataniem upewnij się, że plasterek jest mocno przymocowany siatką.

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Szczep zwierząt: Mysz CD1	Rzeka Karola	22 Rozdział 22
Chlorek wapnia	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał C4901
D-(+)-glukoza	Sigma-Aldrich	Kontroler G8270
HEPESY	Sigma-Aldrich	H3375
Chlorek magnezu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M8266
Siarczan magnezu siedmiowodny	Sigma-Aldrich	230391
Proszek paraformaldehydu, 95%	Sigma-Aldrich	158127
Chlorek potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P3911
Glukonian potasu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1847
Azydek sodu	Sigma-Aldrich	S2002
Wodorowęglan sodu	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy S8875
chlorek sodu	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S5886
sacharoza	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9378
Tryton X-100	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T9284
Baza Trizma	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T1503
Chlorowodorek Trizma	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał T3253
Sód fosforan dwuzasadowy dwuwodny	Sigma-Aldrich	71643
Fosforan sodu jednozasadowy Jednowodny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S9638
Biocytyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał B4261
Alexa Fluor 594 Hydrazyd	ThermoFisher Naukowy	Zobacz materiał A10438
SR95531 (Gabazyna)	Księga Abcam	AB120042
Adenozynotrifosforan (ATP)-Tris	Sigma-Aldrich	A9062
Guanozyna (GTP)-Na+	Sigma-Aldrich	Telefon komórkowy G8877
Oregon Zielony BAPTA-1	ThermoFisher Naukowy	Numer katalogowy O6812
Sól di(tris) fosfokreatyny	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał P1937
Alexa-546 sprzężona ze streptawidyną	ThermoFisher Naukowy	S11225
Łatka kapilar ze szkła borokrzemianowego	Światowe instrumenty precyzyjne	Numer katalogowy: 1B100F-4
Kapilary ze szkła borokrzemianowego Theta	Instrument Suttera	Zobacz materiał BT-150-10
P-97 Ściągacz do mikropipet płomieniowo-brązowych	Instrument Suttera
Konfokalny mikroskop wielofotonowy TCS SP5	Mikrosystemy Leica
Chameleon Ultra II Ti:Szafirowy laser wielofotonowy	Spójne
Oprogramowanie do akwizycji obrazu LAS AF	Mikrosystemy Leica
Regulator temperatury TC-324B	Instrumenty Warnera
Wzmacniacz MultiClamp 700B	Urządzenia molekularne
Digitizer Digidata 1440A	Urządzenia molekularne
Tłumacz konfokalny	Siskiyou powiedział:
Mikromanipulator	Siskiyou powiedział:
Oprogramowanie do akwizycji danych pClamp	Urządzenia molekularne
A365 Izolator bodźców prądu stałego	Światowe instrumenty precyzyjne
Stół optyczny wibratora	Systemy kinetyczne

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: (wersja angielska) powiedział: