Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny komitet ds. opieki nad zwierzętami oraz komisję weterynaryjną JoVE.
1. Montaż pipety rejestrująco-iniekcyjnej
- Wyciągnąć szklaną kapilarnę o długości około 7 cm (średnica zewnętrzna 1 mm) za pomocą ściągacza do pipet.
- Przełam końcówkę kapilary i sprawdź otwór pod mikroskopem świetlnym. Upewnij się, że średnica wewnętrzna wynosi od 30 μm do 40 μm.
- Włóż srebrny drut o długości 7 cm do szklanej kapilary tak, aby około 1 cm wystawał z niestożkowego końca szklanej pipety.
- Zegnij nadmiar filamentu prostopadle do szklanej kapilary.
- Nałożyć kroplę elastycznego kleju z tworzywa sztucznego na trzon igły podskórnej o sile 30 G.
- Wprowadzić igłę podskórną o sile 30 G do szklanej pipety zgodnie ze schematem przedstawionym na rysunku 1.
- Dodaj drugą warstwę kleju, aby zapewnić prawidłowe uszczelnienie od połączenia szklanej pipety z igłą podskórną.
- Pozostaw pipetę do wyschnięcia z końcówką skierowaną do góry na około 12 godzin, aby zapewnić prawidłowe utwardzenie kleju. Końcowy wynik pokazano na rysunku 2.
UWAGA: Ta procedura jest wykonywana w ostrych eksperymentach, a sterylizacja końcówki pipety nie jest wymagana.
2. Przygotowanie zwierząt
- Umieść szczura w pudełku anestezjologicznym.
- Wywołaj znieczulenie za pomocą 4% izofluranu przez 5 do 10 minut.
- Umieść zwierzę na stole stereotaktycznym z poduszką grzewczą i sondą doodbytniczą, aby utrzymać temperaturę ciała 37 °C. Użyj stożka nosowego z 2% izofluranem, aby utrzymać znieczulenie. Zabezpiecz głowę szczura za pomocą nauszników i uchwytu na zęby.
- Zastosuj maść okulistyczną lub krople do oczu, w tym 1% krople atropiny, aby pomóc w rozszerzeniu źrenic. Aby zapobiec wysuszeniu, stosuj krople smarujące mniej więcej co 30 minut.
- Ogol głowę i oczyść ją 10% jodowidonem.
- W celu znieczulenia miejscowego wstrzyknij 0,5 ml 2% lidokainy pod skórę głowy w 2-3 miejscach, unosząc skórę i wkładając końcówkę igły.
- Potwierdź odpowiedni poziom znieczulenia, wykonując uszczypnięcie palca u nogi i obserwując brak ruchu. Ponadto należy monitorować tętno, aby upewnić się, że mieści się w normalnych wartościach (od 300 do 400 uderzeń/min).
- Naciąć skórę głowy w linii prostej wzdłuż mediany za pomocą ostrza skalpela #10, aby odsłonić zarówno szwy czołowe, jak i strzałkowe.
- Odsłoń punkty Lambda i Bregma, odsuwając na bok tkankę pokrywającą czaszkę za pomocą szpatułki chirurgicznej.
- Wypoziomuj czaszkę tak, aby pozycje Bregma i Lambda znajdowały się na tej samej płaszczyźnie.
- Aby ustawić punkt odniesienia, użyj urządzenia stereotaktycznego z zamontowaną szklaną rurką, aby ustawić go tuż nad Bregmą. Będzie to "zero" dla współrzędnych pomiaru przednio-tylnego i przyśrodkowo-bocznego.
- Ustaw punkt zainteresowania, przesuwając montaż stereotaktyczny do wymaganych współrzędnych, zanotuj współrzędne stereotaktyczne i narysuj kwadrat wokół obszaru docelowego, który oznacza miejsce, w którym zostanie wykonana kraniotomia.
- Użyj wiertła chirurgicznego ze sterylizowanym wiertłem wzdłuż zaznaczonego kwadratu powoli, bez nacisku, aby usunąć materiał kostny. Uważaj, aby nie wiercić zbyt długo w tym samym obszarze, ponieważ spowoduje to wytwarzanie ciepła i spowodowanie zmian w korze.
- Gdy kość ograniczająca kraniotomię stanie się wystarczająco cienka, ostrożnie usuń część czaszki pęsetą, aby odsłonić korę.
- Często przepłukuj odsłoniętą korę sztucznym płynem mózgowo-rdzeniowym, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
nuta: Usuwanie opony twardej nie jest konieczne u szczura, ponieważ końcówka iniekcji jest wystarczająco mocna, aby ją przebić.
3. Napełnianie i montaż układu wtryskowego
- Napełnij mikrostrzykawkę o pojemności 5-10 μl przez aspirację olejem mineralnym.
- Napełnij igłę podskórną stałą szklaną pipetą roztworem 0,5% Chicago Sky Blue (CSB) i 300 μM kwasu γ-aminomasłowego (GABA) lub roztworem 2% lidokainy z 0,5% CSB 9. Rozcieńczyć wszystkie roztwory solą fizjologiczną.
- W przypadku obfitej substancji napełnij ją zwykłą strzykawką i zastosuj zwykłe techniki zapobiegawcze, aby uniknąć tworzenia się pęcherzyków powietrza.
- W przypadku droższych substancji do wypełnienia wtrysku można użyć oleju mineralnego, a środek chemiczny można następnie wprowadzić przez aspirację. Różnica gęstości między olejem mineralnym a wodą jest stosunkowo duża, więc substancja ta jest dobrym kandydatem do wstrzykiwania roztworów wodnych.
nuta: Można dodać barwnik, aby potwierdzić separację między obiema cieczami.
- Aby napełnić pipetę do wstrzykiwań, należy odessać strzykawkę o pojemności 1 ml z roztworem i powoli wstrzyknąć ją do pipety.
- Zwrócić szczególną uwagę na nieszczelności w obszarach wskazanych na rysunku 1, pobierając wymaz z tych obszarów do czysta i obserwując wycieki, powoli wstrzykując roztwór strzykawką.
- Wyjąć strzykawkę o pojemności 1 ml. Należy przy tym lekko naciskać na tłok, tak aby podciśnienie nie usunęło roztworu z pipety iniekcyjnej.
- Odessać mikrostrzykawkę olejem mineralnym i mocno przymocować ją do napełnionej pipety iniekcyjnej. Następnie ostrożnie zetrzyj nadmiar roztworu ze zmontowanej wtryskarki gazą.
- Wstrzyknąć bardzo małą objętość, wystarczającą do zobaczenia małej kropli na końcówce szklanej pipety, aby sprawdzić, czy końcówka nie jest zablokowana.
- Zamontuj wtryskiwacz w układzie mikropompy i upewnij się, że jest dobrze zamocowany.
- Ostrożnie ustaw końcówkę wtrysku na współrzędnych docelowych i opuść końcówkę na powierzchnię kory.
- Powoli opuścić iniekcję za pomocą aparatu stereotaktycznego do struktury docelowej (wzgórka górnego) stosując odpowiednie współrzędne anatomiczne.
- Przykryj odsłoniętą korę ciepłym agarem, aby zapobiec wysuszeniu tkanek.
4. Wtrysk i odwracalna dezaktywacja
- Ustawić pompę do mikroiniekcji tak, aby wstrzykiwała 400 do 800 nl przy 40 nl/min i nacisnąć przycisk Uruchom, aby rozpocząć wstrzykiwanie. Należy pamiętać, że szybkość skoku będzie wykazywać zmniejszenie podczas wstrzykiwania.
UWAGA: W konfiguracji eksperymentalnej aktywność neuronalna odzyskała się w ciągu godziny po zakończeniu dostarczania GABA. Każde skalibrowane urządzenie mechaniczne może być użyte do wywierania nacisku na strzykawkę do mikroiniekcji i przeprowadzenia iniekcji.
- Po uzyskaniu danych elektrofizjologicznych należy poddać się eutanazji przy użyciu metody zatwierdzonej przez lokalną Wspólnotę Etyki Zwierząt.
