Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Przygotowanie roztworów
- Przygotuj 500 ml standardowego sztucznego płynu mózgowo-rdzeniowego (ACSF) zawierającego składniki opisane w naszej opublikowanej pracy, jak wymieniono w Tabeli 1.
- Użyj czystych szklanych zlewek z wodą dejonizowaną, aby przygotować świeży roztwór ACSF. Wyczyść szpatułki wodą dejonizowaną i wysusz przed użyciem do dodania chlorku sodu (NaCl), chlorku potasu (KCl), diwodorofosforanu sodu (NaH2PO4), wodorowęglanu sodu (NaHCO3), siarczanu magnezu (MgSO4), D-glukozy i dodaj chlorek wapnia (CaCl2) po przepuszczeniu roztworu z 95%O2 / 5% CO2mieszanina przez ~20 minut (jak wyszczególniono w tabeli 1) do 500 ml wody dejonizowanej. Mieszaj aż do całkowitego rozpuszczenia.
- Upewnij się, że ACSF jest całkowicie przezroczysty bez żadnych opadów. Następnie dostosuj pH do 7,2-7,4. Bąbelek z mieszaniną gazów o składzie 95%O2 i 5% CO2 przez ~20 min.
- Przygotować 250 ml roztworu do krojenia plastrów zawierającego substancje chemiczne opisane w Tabeli 2.
- Dodać KCl, chlorek magnezu (MgCl2), NaH2PO4, NaHCO3, cholinę ·Cl i D-glukozę i dodać chlorek wapnia (CaCl2) jako ostatni, jak wskazano w 1.1.1, do 250 ml wody dejonizowanej i rozpuścić zgodnie z opisem w 1.1.1 i 1.1.2.
- Po bulgotaniu 95% O2/5% CO2 umieścić roztwór w zamrażarce na 15-20 minut, aby roztwór do krojenia stał się lodowaty i częściowo zamrożony.
nuta: Używamy tego roztworu do krojenia podczas robienia plastrów z 1-2 miesięcznych myszy; Formuła może się różnić w przypadku myszy starszych niż 2 miesiące.
- Przygotuj roztwór lipopolisacharydu (LPS), rozpuszczając go w sterylnej, wolnej od endotoksyn soli fizjologicznej (0,9% NaCl). LPS podaje się dootrzewnowo (0,5 mg/kg) i rozpoczyna się zapis po 2 godzinach.
2. Przygotowanie warstwy kory przedczołowej
- Wyjmij roztwór do krojenia z zamrażarki i homogenizuj, aby uzyskać błoto pośniegowe. Umieść roztwór na lodzie i stale bąbelkuj 95% O2/5% CO2 .
- Używając dużych, ostrych nożyczek, szybko odetnij głowę myszy zgodnie z opisem i natychmiast włóż głowę do zlewki wypełnionej lodowatym (0-4°C) roztworem do cięcia.
- Przetnij górną część czaszki wzdłuż linii środkowej w kierunku od ogona do nosa cienkimi nożyczkami i usuń boczne części czaszki. Usuń mózg cienką szpatułką i wrzuć do lodowatego roztworu do cięcia.
nuta: Kroki 2.2-2.3 należy wykonać szybko (najlepiej < 1 minutę).
- Umieść mózg na pokrywie 9-centymetrowej szalki Petriego wypełnionej lodem. Opłucz mózg lodowatym roztworem do cięcia. Odetnij móżdżek i opuszkę węchową żyletką.
- Nałóż klej cyjanoakrylowy na uchwyt próbki wibratomu. Ostrożnie umieść blok mózgu na kropli kleju, rostralną stroną do góry i natychmiast zanurz w lodowatym roztworze do cięcia.
- Ustaw uchwyt ostrza wibratomu pod kątem 15° w stosunku do płaszczyzny poziomej i przygotuj 350-μm koronalne wycinki mózgu (częstotliwość wibracji ostrza = 85 Hz, prędkość = 0,1 mm/s).
- Za pomocą pipety przenieść plastry do komory odzysku wypełnionej ACSF, inkubować przez 1 godzinę (w temperaturze pokojowej) przy stałym bulgotaniu 95% O2/5% CO2 .
3. Nagrywanie łatek z całej komórki
- Szklane mikropipety borokrzemianowe należy wykonać do użytku jako elektrody rejestrujące lub mikropipety do zaciągania się zgodnie ze szczegółowymi wytycznymi zawartymi w instrukcji obsługi ściągacza. Do rejestracji elektrod rezystancje końcówek mieszczą się w zakresie 4-6 MΩ, natomiast mikropipety zaciągowe mają średnice końcówek w zakresie 2-5 μm.
- Dodać bloker kanału Na+ (tetrodotoksyna (TTX), 1 μM), w celu zablokowania szybkiego kanału Na+, a tym samym potencjałów czynnościowych, do ACSF i utrzymać stałe natężenie przepływu tego roztworu wynoszące 2-3 ml / min w komorze rejestracyjnej, poprzez pompę perystaltyczną do komory i zasysanie z niej. Stale bąbelkować ACSF 95% O2/5% CO2, aby zapewnić żywotność plastrów.
- Przenieś wycinek mózgu do komory nagraniowej za pomocą zmodyfikowanej pipety Pasteura, której cienka końcówka została przycięta tak, aby pasowała do rozmiaru wycinka. Przykryj plasterek platynową kotwą z równoległymi nylonowymi nitkami w odstępach ≥2 mm, aby utrzymać plasterek na platformie.
- Napełnić mikropipetę rejestrującą roztworem wewnętrznym (Tabela 3), a mikropipety zaciągnięte kwasem gamma-aminomasłowym (GABA) o stężeniach 10 μM, 50 μM i 100 μM (rozpuszczonym w ACSF) lub ACSF jako kontrola nośnika.
- Aby zapobiec zablokowaniu przez zanieczyszczenia, przed zanurzeniem elektrody rejestrującej w ACSF należy zastosować lekkie nadciśnienie za pomocą strzykawki o pojemności 1 ml. Za pomocą mikromanipulatora pod mikroskopem (soczewka obiektywu 4x) ustaw elektrodę rejestrującą i mikropipetę zaciągającą się tak, aby końcówki znalazły się na środku obrazu wideo na monitorze (rysunek 1A).
- Wyreguluj ostrość mikroskopu (soczewka obiektywu 40x), stopniowo obniżając mikropipetę puff i umieść ją nad neuronem rejestrującym pod kątem 45°. Odległość między końcówką mikropipety zaciągającej się a neuronem powinna wynosić od 20 do 40 μm (ryc. 1B). Powoli i ostrożnie zbliż się do neuronu z elektrodą rejestrującą, a następnie zwolnij nadciśnienie. Zastosuj słabe i krótkie ssanie przez rurkę podłączoną do uchwytu elektrody, aby uzyskać uszczelnienie giga-omowe.
- Utrzymuj napięcie na poziomie 0 mV. Po utworzeniu uszczelki giga-omowej należy skompensować szybką i wolną pojemność ręcznie lub automatycznie. Następnie zastosuj krótkie i mocne ssanie przez wspomniane powyżej rurki, aby przejść w tryb całej komórki.
- Nagrywaj eIPSC w trybie cęgów napięciowych. Zastosuj niskie ciśnienie gazu (azot, 4 - 6 psi) do mikropipety pufowej za pomocą Picospritzera sterowanego przez generator krokowy napięcia Master 8, aby dostarczyć pojedyncze lub sparowane zaciągnięcia GABA (Rysunek 2).
Tabela 1. Nagrywanie ACSF.
TGL
TGL
Czółenka
jezdnego
zł
jezdnego
TGL
TGL
jedn.
pkt.
pkt.
pkt.
| substancja | g/mol | Stężenie (mM) | Waga (g/L) |
| Zawartość NaCl | 58.443 | Rozdział 119 | 6,9547 |
| Kcl | 74.551 | Rozdział 2.5 | 0,1864 |
| NaH2PO4 | 137,99 | 1 | 0,1380 |
| NaHCO3 | 84.007 | Rozdział 26,2 | 2.2010 |
| MgSO4 | 120 366 | 1.3 | 0,1565 |
| D-glukoza | 198,17 | 11 | Nr kat. 2,1799 |
| CaCl2 | 110,98 | Rozdział 2.5 | 0,2775 |
Tabela 2. Roztwór do krojenia plastrów.
Czółenka
jezdnego
TGL
TGL
zł
jedn.
TGL
pkt.
TGL
pkt.
jedn.
pkt.
| substancja | g/mol | Stężenie (mM) | Waga (g/L) |
| Kcl | 74.551 | Rozdział 2.5 | 0,1864 |
| MgCl2 | Numer katalogowy 95.211 | 7 | 0,6665 |
| NaH2PO4 | 137,99 | Wydanie orzeczenia 1,25 | 0,1725 |
| NaHCO3 | 84.007 | 25 | Nr 2,1002 |
| Cholina·Cl | 139,63 | Rozdział 115 | 16.0575 |
| D-glukoza | 198,17 | 7 | 1,3872 |
| CaCl2 | 110,98 | 0,5 | 0,0555 ziarna |
Tabela 3. Wewnętrzne rozwiązanie do nagrań łatek z całych komórek.
TGL
szt.
TGL
pkt.
TGL
TGL
TGL
jezdnego
pkt.
TGL
KM
jedn.
| substancja | g/mol | Stężenie (mM) | Waga (g/L) |
| Cs glukonian | Numer katalogowy: 328.052 | 100 | Numer katalogowy: 32.8052 |
| CsCl | 168,36 | 5 | 0,8418 |
| HEPESY | Numer katalogowy 238.301 | 10 | Nr kat. 2,3830 |
| MgCl2 | Numer katalogowy 95.211 | cyfra arabska | 0,1904 |
| CaCl2 | 110,98 | 1 | 0,1110 |
| BAPTA (Biblioteka BAPTA) | Numer katalogowy: 476.433 | 11 | 5,2408 |
| Na2ATP | 551,1 | 4 | Klasa 2,2044 |
| Na2GTP | 523,2 pkt. | 0,4 | 0,2093 |
