$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury związane z pobieraniem próbek zostały przeprowadzone zgodnie z wytycznymi instytutu IRB.
1. Rozwiązania zewnętrzne i wewnętrzne
- Roztwór Ringera należy stosować u ssaków podczas rozwarstwiania siatkówki oraz jako roztwór zewnętrzny w późniejszym zapisie elektrofizjologicznym. Przygotować roztwór Ringera ssaków z 10-krotnego roztworu podstawowego (bez wapnia) w dniu rejestracji i dodać kroplami CaCl2 po 15 minutach karbonowania (95%O2 i 5% CO2 ). Końcowy roztwór 1x zawiera (w mM): 120 NaCl, 5 KCl, 25 NaHCO3, 0,8 Na2HPO4, 0,1 NaH2PO4, 2 CaCl2, 1MgSO4 i 10 D-glukozy.
- Użyj dwóch wewnętrznych rozwiązań, aby scharakteryzować oscylacje SAC. Zbadać przydatność przygotowanych roztworów w przedłużonych zapisach klamer krosowych całokomórkowych na dorosłych komórkach siatkówki myszy (RGC) i przechowywać zweryfikowane partie w podwielokrotnościach o objętości 500 μl w temperaturze -20 °C do czasu użycia.
- Do rejestrowania oscylacji potencjału błonowego należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie potasu, który zawiera (w mM): 125 K-glukonian, 8 NaCl, 4-adenozynotrifosforan (ATP)-Mg, 0,5 trifosforan Li-guanozyny (GTP), kwas tetraoctowy 5-glikolu etylenowego (EGTA), 10 kwas 4-(2-hydroksyetylo)-1-piperazynoetanosulfonowy (HEPES) i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą KOH.
- Do rejestrowania pobudzających i hamujących prądów postsynaptycznych należy użyć wewnętrznego roztworu na bazie cezu, który zawiera (w mM): 100 Cs-metanosulfonianu, 8 NaCl, 4 ATP-Mg, 0,5 Li-GTP, 5 EGTA, 10 HEPES i 0,2% biocytyny (w/v). Dostosuj pH do 7,3 za pomocą CsOH.
2. Przygotowanie do Dnia Nagrania
- Aby przygotować membranę nitrocelulozową z otwartymi otworami, należy ręcznie przebić membranę za pomocą specjalnego dziurkacza wykonanego z igły strzykawkowej 16 G i spłaszczyć membranę między dwiema czystymi szklanymi płytkami. W przypadku siatkówki z pełnym mocowaniem wykonaj centralny otwór o średnicy 0,2 mm i otocz go 4 większymi otworami o średnicy 1-1,2 mm.
- Aby uzyskać niestandardowy filament do wypełniania do ładowania roztworu wewnętrznego do elektrod, stopić końcówkę pipety o pojemności 10 μl na środku i delikatnie wydłużyć stopioną część, aż ostygnie i stwardnieje. Tuż przed użyciem użyj czystej żyletki, aby przyciąć filament, aż będzie nieco dłuższy niż pipety z plastrem.
- Wyciągnij pipety plastrowe w programowalnym ściągaczu z rurki ze szkła borokrzemianowego z wewnętrznym żarnikiem. Mikropipety należy wyprodukować w dniu eksperymentu i natychmiast je zużyć.
nuta: Do nagrywania SAC używamy następującego ustawienia ściągacza: ciepło: 484; uciąg: 0; prędkość: 25; czas opóźnienia: 1; Ciśnienie: 400 i wartość rampy 462. Średnica zewnętrzna (OD) i średnica wewnętrzna (ID) rur borokrzemianowych wynosi odpowiednio 1,65 mm i 1,0 mm. Rezystancja pipet wynosi 10-14 MΩ.
- Na godzinę przed pobraniem tkanek rozmrozić probówkę z roztworem wewnętrznym, potrząsając nią na wirze przez >30 min.
3. Rozwarstwienie siatkówki
- Znieczulij zwierzę 4% izofluranem w tlenie, aż zwierzę straci reakcję na uszczypnięcie palca u nogi. Złóż zwierzę w ofierze przez zwichnięcie szyjki macicy.
- Odetnij obie gałki oczne od nerwów wzrokowych w odległości 1-2 mm od główek nerwu wzrokowego za pomocą nożyczek do tęczówki z prostym zakończeniem.
- Rzuć gałki oczne na czysty ręcznik papierowy, aby usunąć krew, a następnie zanurz je w roztworze Ringera karbogenowanych ssaków. Przebij otwór w rąbku igłą 23 G i przetnij gałki oczne, przecinając wzdłuż rąbka mikronożyczkami. Usuń rogówkę i soczewkę za pomocą drobnych kleszczyków.
- W przypadku całego montażu siatkówki delikatnie oderwij całą siatkówkę od pigmentowanego nabłonka za pomocą cienkich kleszczyków i wykonaj cztery 1,5-2 mm ortogonalne nacięcia od krawędzi w kierunku głowy nerwu wzrokowego.
- Zanurz dziurkowaną membranę nitrocelulozową w naczyniu i delikatnie przeciągnij po niej siatkówkę warstwą komórek zwojowych (GCL) do góry. Umieść głowę nerwu wzrokowego w środkowym otworze podczas przygotowywania całej siatkówki. Przenieś błonę z siatkówką do innego czystego naczynia. Delikatnie spłaszcz siatkówkę cienkim pędzlem, aby wyglądała jak krzyż maltański i połóż wszystkie cztery krawędzie na otworach.
- Jeśli jednorazowo ma być badana część siatkówki, należy przeciąć każdą muszlę oczną przygotowaną z kroku 3.3 na 3-4 części za pomocą żyletki z przyczepionymi resztkami pigmentowanego nabłonka. Niewykorzystane kawałki należy chronić przed światłem w karbogenicznym roztworze zewnętrznym i zużyć w ciągu 12 godzin.
- Osusz membranę nitrocelulozową kawałkiem suchej bibuły filtracyjnej i usuń szklistą i wewnętrzną membranę ograniczającą za pomocą kleszczy i pędzla.
- Upewnij się, że wszystkie krawędzie siatkówki są całkowicie przymocowane do membrany przed przeniesieniem zespołu do komory nagrywającej z uszczelnionym szklanym szkiełkiem nakrywkowym na dole. Przymocuj membranę smarem próżniowym do szkiełka nakrywkowego i ponownie nawodnij siatkówkę roztworem zewnętrznym. Uważaj, aby nie uwięzić żadnych pęcherzyków powietrza pod zespołem.
- Ustaw komorę na stoliku mikroskopu pionowego. Ukrwić komorę ciepłym (34-35 °C) karbogenicznym roztworem zewnętrznym w ilości ~3 ml na minutę.
- Najpierw zbadaj siatkówkę pod soczewką obiektywu 10x, a następnie użyj soczewki zanurzonej w wodzie 60x, aby zobaczyć neurony GCL i wewnętrznej warstwy jądrowej (INL) pod wpływem kontrastu interferencyjnego różnicowego (DIC) i/lub epifluorescencji. Aby uwidocznić SAC wykazujące ekspresję tdTomato, należy użyć źródła światła z białą diodą elektroluminescencyjną (LED) w połączeniu z filtrem wzbudzenia o długości fali 554 nm i filtrem emisyjnym o długości fali 581 nm.
4. Nagrywanie z użyciem clampu krosowego całej komórki z płaskiej siatkówki
- Przefiltruj roztwór wewnętrzny przez filtr strzykawkowy do niestandardowego filamentu do wypełniania.
- Włóż filament do świeżo wyciągniętej mikropipety i dozuj roztwór wewnętrzny w pobliżu końcówki, aż roztwór pokryje srebrny drut elektrody na >5 mm. Zamocuj mikropipetę na uchwycie elektrody z kijkiem ssącym, za pomocą którego można regulować ciśnienie wewnątrz elektrody, popychając lub pociągając tłok plastikowej strzykawki o pojemności 10 ml podłączonej do rurki.
- Znajdź pipetę pod obiektywem i zejdź ją do ~100 μm powyżej siatkówki. W trybie wtórnika prądowego (I = 0) użyj przesunięcia DC, aby wyzerować stojący sygnał napięcia DC. Zmierz rezystancję pipety w trybie cęgów prądowych (IClamp), wstrzykując prądy o fali prostokątnej o stałej amplitudzie przez pipetę, gdy znajduje się ona w kąpieli, i zneutralizuj różnicę, obracając pokrętło Raccess. Użyj odczytu na pokrętle Raccess, aby obliczyć rezystancję pipety zgodnie z prawem Ohma.
- Powoli ustaw elektrodę na wysokości ~10 μm nad siatkówką. Zastosuj nadciśnienie do elektrody. Obserwuj, jak zmienia się odbicie w pobliżu końcówki pipety, gdy zbliża się ona do siatkówki. Szybko, ale delikatnie wepchnij pipetę do GCL i natychmiast zmniejsz nadciśnienie.
- Przesuń pipetę w kierunku oznakowanego neuronu. Unikaj kontaktu z innymi neuronami, naczyniami krwionośnymi i końcami nóg komórek Müllera. W razie potrzeby zastosuj większe nadciśnienie, aby zapobiec zatkaniu elektrody.
- Umieść końcówkę pipety w pobliżu linii środkowej znakowanego neuronu, aż będzie widoczny wgłębienie. Zwolnij nadciśnienie i pozwól, aby błona plazmatyczna odbiła się z powrotem na końcówkę pipety.
- Zastosuj do pipety prądy ujemne o natężeniu od 20 do 120 pA, aby pomóc w tworzeniu uszczelnienia giga-omowego. W razie potrzeby zastosuj delikatne ssanie, aby wciągnąć błonę plazmatyczną do pipety. Odczekaj 5 minut po utworzeniu uszczelnienia, aby pękła błona komórkowa. Pozwala to na usunięcie rozlanego roztworu wewnętrznego przez superfuzję. Rozerwij membranę przez delikatne zasysanie.
- Po pęknięciu membrany i w bieżącym trybie zacisku włącz balans mostka i wyreguluj go za pomocą pokrętła Raccess.
nuta: W przypadku małej komórki, takiej jak SAC, potrzebna jest tylko niewielka regulacja, jeśli w ogóle. Alternatywnie, rejestruj pobudzające i hamujące prądy postsynaptyczne w trybie zacisku napięciowego (VClamp), utrzymując komórkę przy potencjałach odwrócenia odpowiednio chlorku (około -75 mV) i glutaminianu (około 0 mV). W razie potrzeby sprawdź i wyreguluj położenie pipety, aby dostosować się do sporadycznego dryfu siatkówki i/lub mikromanipulatora.
- Aby zarejestrować potencjał błonowy lub zmianę prądu przed, w trakcie i po leczeniu farmakologicznym, należy przygotować blokery synaptyczne (np. cyjankiksalinę [CNQX], (2R)-amino-5-fosfonopentanoinian [AP5], pikrotoksynę, tubokurarynę itp.) i modulatory kanałów (np. flupirtynę, dopaminę, kwas meklofenamowy itp.) świeże w dniu doświadczenia z zamrożonych zapasów. Rozcieńczyć leki karbogenicznym roztworem Ringera. Nakładaj je partiami poprzez perfuzję.
- Po nagraniu delikatnie wyjmij pipetę z somy. Przenieś zestaw z komory do czystego naczynia. Odłącz i ponownie przymocuj siatkówkę do innej spłaszczonej membrany nitrocelulozowej bez wybitych otworów, aby zapewnić płaskość siatkówki podczas mocowania.