Zapisy elektrofizjologiczne do oceny regeneracji neuronów w współhodowanych wycinkach rdzenia kręgowego

Streszczenie

Źródło: Heidemann, M., et al. Badanie funkcjonalnej regeneracji w organotypowych kokulturach rdzenia kręgowego hodowanych na układach wieloelektrodowych. J. Vis. Exp. (2015).

Ten film prezentuje nagrania elektrofizjologiczne z organotypowych kokultur wycinków rdzenia kręgowego, uchwycone za pomocą matrycy wieloelektrodowej lub urządzenia MEA. Nagrania te oceniają regenerację neuronów między warstwami. Zaobserwowana zsynchronizowana aktywność elektryczna potwierdza udaną regenerację neuronów.

Protokół

Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.

1. Montaż wycinków tkanki rdzenia kręgowego na MEA

1. Podgrzać sterylną pożywkę w inkubatorze (37 °C, lekko odkręcona pokrywka do natlenienia).
2. Umieść matrycę wieloelektrodową lub MEA za pomocą sterylnej pęsety z gumowymi końcówkami w temperaturze pokojowej (RT) na szalce Petriego pod mikroskopem stereoskopowym z ustawioną ostrością układu elektrod. Wyśrodkuj kroplę 6 μl osocza kurzego na czystym, wolnym od kurzu i sterylnym układzie elektrod. Za pomocą małej szpatułki ostrożnie wsuń dwa odcinki rdzenia kręgowego z brzusznymi bokami skierowanymi do siebie do kropli osocza. Nie dotykaj elektrod szpatułką.
3. Dodać 8 μl trombiny wokół kropelki osocza kurczaka. Używając końcówki pipety trombinowej, ostrożnie wymieszaj i rozprowadź mieszaninę osocza kurczaka/trombiny wokół dwóch plasterków. Również w tym przypadku nie należy dotykać bezpośrednio kruchego układu elektrod. Tuż przed krzepnięciem odessać nadmiar osocza kurczaka/trombiny.
4. Zakryj szalkę Petriego, aby utrzymać wysoką wilgotność, podczas gdy zespół MEA/kultura siedzi przez około 1 godzinę w wilgotnej komorze wewnątrz inkubatora w temperaturze 37 °C.
5. Ostrożnie dodaj 10 μl pożywki do komory hodowlanej, zakryj szalkę Petriego i włóż z powrotem do inkubatora na około 30 minut.
6. Umieść każdy zestaw MEA/kultura ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami w rurce rolkowej, dodaj 3 ml pożywki i szczelnie zamknij pokrywkę. Umieścić rurkę rolkową w bębnie rolkowym, obracającą się z prędkością 1–2 obr./min w inkubatorze w atmosferze zawierającej 5% CO₂ w temperaturze 37 °C.
7. Zmienić połowę pożywki po 7 dniach in vitro (DIV), a następnie 1-2 razy w tygodniu.

2. Uszkodzenia mechaniczne

1. Wyjmij zestaw MEA/kultura ze sterylnymi, pokrytymi gumą końcówkami z rurki rolkowej i umieść na szalce Petriego bez pożywki pod mikroskopem stereoskopowym z tkanką w ostrości. Sprawdź wzrokowo, czy dwa plasterki są połączone.
2. Trzymaj zespół MEA/kultura stabilnie, umieszczając pęsetę z gumowymi końcówkami na MEA.
3. Umieść ostrze skalpela w rowku MEA w pobliżu plastrów tkanki. Trzymaj skalpel raczej poziomo.
4. Podnieś rękojeść skalpela do góry, ale pozwól ostrzu skalpela pozostać w rowku MEA w taki sposób, aby ostrze "toczyło się" od podstawy do czubka, a tym samym przecinało tkankę pokrywającą rowek.
5. W razie potrzeby należy utwardzić wszelkie resztki połączeń tkankowych za pomocą końcówki igły 25 G. Pracuj tylko w obszarze w rowku i nie dotykaj delikatnych krawędzi.
6. Włóż zestaw MEA/kulturę z powrotem do rury rolkowej. Dostarczyć 3 ml świeżej pożywki do kultur i umieścić je z powrotem w bębnie rolkowym w inkubatorze.

3. Elektrofizjologiczne zapisy spontanicznej aktywności

1. Aby zbadać funkcjonalną regenerację między dwoma wycinkami rdzenia kręgowego po wybranej liczbie DIV, zamontuj zespół MEA/hodowla w komorze rejestracyjnej pod mikroskopem i nałóż około 500 μl roztworu zewnątrzkomórkowego (patrz lista materiałów).
2. Odczekaj 10 minut przed pierwszym nagraniem, aby system się ustabilizował.
3. Rejestruj podstawową spontaniczną aktywność 2x przez około 10 minut z każdej elektrody wykrywającej aktywność MEA w RT.
4. Aby zapewnić stabilne, zewnątrzkomórkowe warunki, wymieniaj się roztworem zewnątrzkomórkowym po każdej sesji nagraniowej.
5. Aby odhamować sieć, należy zastosować zewnątrzkomórkowy roztwór zawierający strychninę (1 μM) i gabazynę (10 μM). Odczekaj co najmniej 2 minuty przed rozpoczęciem nagrywania.

4. Analiza danych

UWAGA: Do wykrywania pozakomórkowych potencjałów czynnościowych użyj detektora opartego na odchyleniach standardowych i późniejszym dyskryminatorze dla każdej elektrody.

1. Wyświetlanie wykrytej aktywności neuronalnej każdej elektrody na wykresie rastrowym zgodnie ze standardowymi procedurami (rysunek 1F).
2. Określ i wyświetl całkowitą aktywność sieciową dla każdego wycinka, podsumowując liczbę zdarzeń w odpowiednich kanałach w przesuwanym oknie o 10 ms, przesuniętym o krok co 1 ms (Rysunek 1G).
3. Wykryj w każdym wycinku pojedyncze impulsy (skupiska aktywności, które pojawiają się na kilku elektrodach). W związku z tym należy ustawić minimalny próg szczytowej aktywności w odpowiedniej całkowitej aktywności sieci i zdefiniować każdy początek i koniec serii. Na przykład odpowiedni próg to 25% średniej amplitudy serii, a początek serii można zdefiniować jako pierwsze zdarzenie w oknie czasowym trwającym co najmniej 5 ms, a koniec serii jako ostatnie zdarzenie w oknie czasowym wynoszącym co najmniej 25 ms.
4. Aby określić ilościowo regenerację funkcjonalną, oblicz procent zsynchronizowanych serii między dwoma wycinkami. Aby to zrobić, oblicz opóźnienie między serią w jednym wycinku a następną serią w drugim wycinku.
   nuta: Para serii jest nazywana "zsynchronizowaną", gdy opóźnienie jest mniejsze niż średnia długość serii. Szczególnie w kokulturach o dużej aktywności istnieje możliwość, że obie strony przypadkowo zainicjują impuls w wybranym oknie opóźnienia. Fakt ten musi być brany pod uwagę przy określaniu procentu zsynchronizowanych impulsów.

Wyniki

Rysunek 1. Wyświetlanie i analiza spontanicznej aktywności. (a) Schemat MEA. Elektrody pokryte platyną są przedstawione w kolorze czarnym, przezroczyste druty w kolorze czerwonym, a rowek w środku MEA w kolorze żółtym. (B) Zbliżenie na układ elektrod znajdujących się w środku MEA. (C) Obraz w jasnym polu starej kultury 8 DIV. Plastry urosły i stopiły się wzdłuż boków zwróconych do siebie. Żółty pase...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
Planarny układ wieloelektrodowy	Nauki biologiczne Qwane		wykonane na zamówienie według projektu naszego laboratorium
Pożywka			Na 100 ml
Dulbeccos zmodyfikował podłoże Eagle's	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy: 31966-021	Pojemność 80 ml
Surowica konia	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 26050-070	Pojemność 10 ml
woda destylowana, sterylna			Pojemność 10 ml
Czynnik wzrostu nerwów-7S [5ng / mL]	Sigma-Aldrich	N0513	200 μl
			rozpuszczony w roztworze myjącym z 1% BSA
Żel do macierzy zewnątrzkomórkowej	BD Nauki biologiczne	Numer katalogowy: 356230	Musi pozostać zimny przez cały czas; rozcieńczyć w stosunku 1:50 pożywką zoptymalizowaną dla neuronów prenatalnych i embrionalnych
Roztwór zewnątrzkomórkowy (pH 7,4)			[mM]
Zawartość NaCl			Rozdział 145
Kcl			4
MgCl2			1
CaCl2			cyfra arabska
HEPESY			5
Na-pirogronian			cyfra arabska
glukoza			5
Gabazyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał SR-95531
Mikropipeta	Światowe instrumenty precyzyjne, Inc.	MF28G-5
strychnina	Sigma-Aldrich	S0532	toksyczny
Płaska rurka do hodowli tkankowej 10 (= rurka rolkowa)	Techno Plastic Products AG	Numer katalogowy: 91243

TGL powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: