Pomiary elektrofizjologiczne i analiza nocycepcji u niemowląt

Podsumowanie

Ocena i leczenie bólu u niemowląt jest trudne, ponieważ nie są one w stanie werbalnie zgłosić swoich odczuć. W tym filmie opisujemy ilościowe metody elektrofizjologiczne oraz techniki analizy, które mogą być wykorzystane do pomiaru reakcji układu nerwowego niemowlęcia na bodźce szkodliwe.

Streszczenie

Ból jest nieprzyjemnym doświadczeniem sensorycznym i emocjonalnym. Ponieważ niemowlęta nie potrafią werbalnie relacjonować swoich doświadczeń, obecne metody oceny bólu opierają się na behawioralnych i fizjologicznych reakcjach organizmu, takich jak płacz, ruchy ciała lub zmiany wyrazu twarzy. Chociaż miary te wykazują, że niemowlęta wykazują odpowiedź po stymulacji nocyceptywnej, są one ograniczone: opierają się na aktywacji podkorowych somatycznych i autonomicznych dróg ruchowych, które mogą nie być wiarygodnie powiązane z centralnym przetwarzaniem sensorycznym w mózgu. Wiedza o tym, jak ośrodkowy układ nerwowy reaguje na zdarzenia nocyceptywne, mogłaby dostarczyć wglądu w to, w jaki sposób informacje nocyceptywne i ból są przetwarzane u noworodków.

Procedura nakłuwania pięty stosowana do pobierania krwi od hospitalizowanych niemowląt stwarza wyjątkową okazję do badania bólu w okresie niemowlęcym. W tym filmie opisujemy, w jaki sposób elektroencefalografia (EEG) i elektromiografia (EMG) zsynchronizowane czasowo z tą procedurą mogą być wykorzystane do badania aktywności nocyceptywnej w mózgu i rdzeniu kręgowym.

To zintegrowane podejście do pomiaru bólu u niemowląt może utorować drogę do stworzenia skutecznego i czułego narzędzia pomiarowego w praktyce klinicznej.

Protokół

Przed przeprowadzeniem jakichkolwiek badań na niemowlętach należy uzyskać zgodę komisji etycznej oraz pisemną i świadomą zgodę rodziców.

W niniejszym badaniu uzyskano zgodę komisji etycznej University College Hospital oraz pisemną i świadomą zgodę rodziców przed każdym zabiegiem. Badanie zostało przeprowadzone zgodnie ze standardami określonymi w Deklaracji Helsińskiej oraz wytycznymi Dobrej Praktyki Klinicznej.

1. Gromadzenie danych – konfiguracja

1. Po przygotowaniu skóry umieść na głowie niemowlęcia co najmniej 16 pojedynczych jednorazowych elektrod EEG Ag/AgCl zgodnie z systemem rozmieszczenia elektrod 10-20 (Rysunek 1A). Bardziej kompleksowy zasięg można osiągnąć, stosując czepek EEG z wbudowanymi elektrodami. Użycie czepka EEG sprawia, że proces jest szybszy i mniej uciążliwy, szczególnie że elektrody są przygotowywane z żelem przewodzącym przed nałożeniem czepka na głowę. Aplikacja jednorazowych elektrod EEG wymaga więcej czasu i umiejętności, ale zazwyczaj skutkuje lepszym zapisem. Rozważ zmniejszenie liczby elektrod w przypadku ograniczonego dostępu do niemowlęcia, jednak zawsze stosuj elektrody linii środkowej (Cz, CPz i FCz). Jako elektrodę referencyjną do zapisu wykorzystaj FCz.
2. Użyj przewodzącej pasty do EEG, aby zoptymalizować sprzężenie elektryczne elektroda/skóra.
3. Nałóż na elektrody elastyczną siatkę, aby utrzymać je na miejscu.
4. Zwiąż przewody elektrod, aby zminimalizować zakłócenia elektryczne.
5. Umieść elektrodę uziemiającą na klatce piersiowej lub głowie.
6. Po przygotowaniu skóry umieść elektrody EMG na mięśniu dwugłowym uda w obu nogach (Rysunek 1B).
7. Aby zapisać aktywność ECG, po przygotowaniu skóry umieść na ciele elektrody ECG odprowadzenia 1 (jedną elektrodę po lewej stronie klatki piersiowej, jedną po prawej i użyj tej samej elektrody uziemiającej, co w przypadku EEG).
8. Umieść przetwornik ruchu na brzuchu, aby mierzyć oddech.
9. Umieść sondę pulsoksymetryczną na stopie, aby mierzyć saturację tlenową i częstość akcji serca. Upewnij się, że sonda jest zabezpieczona na miejscu i że rejestrowany jest ciągły sygnał bez przerw. Sondę pulsoksymetru należy umieścić na stopie przeciwległej do stopy, którą zamierzasz stymulować.
10. Ustaw zamontowaną na statywie kamerę tak, aby objęła twarz niemowlęcia, co pozwoli na rejestrację zmian w wyrazie twarzy.
11. Umieść diodę emitującą światło (LED) w kadrze kamery. Dioda LED jest połączona z układem czasowym, dzięki czemu będzie migać w momencie prezentacji stymulacji, aby zsynchronizować zapis EEG, EMG i wideo.

2. Gromadzenie danych - rejestracja

1. Rozpocznij nagrywanie wideo.
2. Rozpocznij pomiar pulsoksymetrii.
3. Rozpocznij rejestrację EEG/EMG.
4. Odczekaj, aż niemowlę się uspokoi.
5. Przytrzymaj stopę tak, jakby należało wykonać nakłucie pięty, i ręcznie zaznacz zdarzenia w zapisach EEG i EMG. Epoka ta zostanie wykorzystana do identyfikacji fragmentu kontrolnego tła EEG i EMG.
6. Zastosuj stymulację dotykową, lekko stukając gumowym korkiem przymocowanym do ramienia młotka neurologicznego o powierzchnię pięty. Stymuluj stopę, która nie jest podłączona do pulsoksymetru. W momencie stymulacji niemowlęcia należy zaznaczyć zdarzenia w zapisie EEG/EMG i nagraniu wideo, aby zidentyfikować czas wystąpienia stymulacji w nagraniu. Stymulację dotykową można zaznaczyć poprzez podłączenie głowicy impedancyjnej do młotka neurologicznego, co elektronicznie łączy stymulator z urządzeniem rejestrującym. Nagranie wideo jest zaznaczane za pomocą błysku diody LED. Można zastosować wielokrotne dotknięcia, a bodziec może być aplikowany w różnych obszarach ciała, np. na ramieniu.
7. Zastosuj kontrolną stymulację niebolesną, obracając lancet o 90 stopni i przykładając go do stopy w taki sposób, aby po zwolnieniu sprężynowego ostrza nie miało ono kontaktu ze skórą. Zdarzenie to można zsynchronizować czasowo za pomocą akcelerometru przymocowanego do górnej powierzchni lancetu. Akcelerometr wykrywa wibrację występującą podczas zwolnienia ostrza.
8. Wykonaj klinicznie niezbędne nakłucie pięty zgodnie z praktyką kliniczną na oddziale noworodkowym. Przed wykonaniem nakłucia pięty odczekaj, aż aktywność EEG się ustabilizuje. Synchronizacja czasowa nakłucia pięty może być wykonana w ten sam sposób, co w przypadku stymulacji kontrolnej. Po nakłuciu pięty nie uciskaj stopy przez co najmniej 30 sekund, aby upewnić się, że zarejestrowane reakcje wynikają wyłącznie z samego nakłucia.
9. Upewnij się, że pobrano wymaganą ilość krwi i przygotuj próbki do analizy klinicznej.
10. Zapisz dane i zatrzymaj wszystkie pomiary.
11. Zapisz dane demograficzne niemowlęcia oraz szczegóły eksperymentu i wprowadź je do bazy danych w celu bezpiecznego przechowywania i przyszłych odniesień.
12. Powtórz tę procedurę w wymaganej próbie niemowląt. W tym przykładzie liczba niemowląt = 23.

3. Analiza danych EEG

1. Utwórz epoki EEG o długości 1,7 s odpowiadające każdemu dotknięciu, stymulacji kontrolnej i kłującej oraz tłu EEG. Epoki powinny rozpoczynać się 0,6 s przed każdym zdarzeniem. Liczba epok dla każdej modalności powinna być taka sama.
2. Wykonaj korekcję linii bazowej epok poprzez odjęcie średniego sygnału bazowego i zastosuj filtr górnoprzepustowy przy 0,1 Hz.
3. Do dalszej analizy wybierz epoki zarejestrowane w elektrodach CPz lub Cz i odrzuć epoki zanieczyszczone artefaktami ruchowymi. Artefakt ruchowy definiuje się jako zmianę amplitudy większą niż 50μV w czasie krótszym niż 50ms.
4. Wyrównaj ślady w celu skorygowania jittera latencji w przedziale od 50 do 300 ms po stymulacji i przeprowadź analizę głównych składowych (PCA) w tym przedziale czasowym, aby zidentyfikować potencjał dotykowy (tj. aktywność EEG związaną ze stymulacją dotykową). Przyjmij epoki jako zmienne, a punkty czasowe jako obserwacje. PCA rozkłada epoki EEG na podstawowe kształty fal, zwane głównymi składowymi (PCs), które reprezentują systematyczną zmienność amplitudy sygnału w czasie.
5. Przeprowadź jednoczynnikową analizę wariancji (ANOVA) dla wag każdej z dwóch pierwszych składowych PC, aby określić, która z nich reprezentuje potencjał dotykowy. Będzie to ta składowa PC, której wagi były znacząco większe po stymulacji dotykowej w porównaniu do tła EEG.
6. Wyrównaj ślady w celu skorygowania jittera latencji w przedziale od 300 do 700 ms po stymulacji i przeprowadź PCA w tym przedziale czasowym.
7. Przeprowadź jednoczynnikową analizę ANOVA dla wag każdej z dwóch pierwszych składowych PC, aby określić, która z nich reprezentuje potencjał specyficzny dla nocycepcji. Będzie to ta składowa PC, której wagi były znacząco większe po stymulacji nocyceptywnej w porównaniu do stymulacji dotykowej i tła EEG.

4. Analiza danych EMG

1. Obliczyć wartość średnia kwadratowa (RMS) sygnału EMG w pierwszych 1000 ms po stymulacji dla bodźców kontrolnych oraz bodźców typu „lance”.
2. Przeprowadzić test t dla wartości RMS, aby określić nocyceptywny odruch wycofania na poziomie rdzenia kręgowego.

5. Reprezentatywne wyniki

Rysunek 1. (A) (i) Schemat oraz (ii) zdjęcie rozmieszczenia elektrod do pomiarów EEG (zmodyfikowany międzynarodowy system rozmieszczenia elektrod 10/20); (B) Schemat rozmieszczenia elektrod do pomiarów EMG mięśnia dwugłowego uda.

Rysunek 2. (A) Przykłady potencjału sensorycznego w punkcie Cz wywołanego dotykiem u 3 niemowląt; (B) przykłady potencjału specyficznie nocyceptywnego w punkcie Cz wywołanego bodźcem boleśniego nakłucia u 3 niemowląt.

Rysunek 3. Zależność wag głównych składowych (PC) od modalności bodźca w punkcie Cz (średnia ± SEM). PC uzyskany w przedziale 50-300 ms po wystąpieniu bodźca reprezentuje potencjał dotykowy, a PC uzyskany w przedziale 300-700 ms po wystąpieniu bodźca reprezentuje potencjał specyficzny dla nocycepcji. Składowe PC (linie pogrubione) są nałożone na średnie ogólne uzyskane dla wszystkich typów stymulacji (EEG tła, dotyk, bodziec nocyceptywny lancetem) po wyrównaniu poszczególnych śladów w określonym przedziale czasowym.

Rycina 4. (A) Przykład aktywności EMG u jednego niemowlęcia po (i) nocyceptywnym nakłuciu pięty oraz (ii) dotknięciu pięty. (B) Średnia (±SE) wartość średnia kwadratowa (RMS) aktywności EMG u niemowląt po nocyceptywnym i nienocyceptywnym bodźcu dotykowym w obrębie pięty.

Dyskusja

W niniejszym filmie pokazano, w jaki sposób za pomocą zapisów EEG i EMG można charakteryzować odpowiedzi elektrofizjologiczne wywołane stymulacją dotykową i nocyceptywną u niemowląt. Badania tego typu pomogą zrozumieć rozwój i plastyczność procesów przetwarzania bólu u ludzi, a także przyczynią się do poprawy oceny klinicznej i leczenia bólu u niemowląt ^{1, 2}.

Sukces tych eksperymentów wymaga ścisłej współpracy zespołu multidyscyplinarnego. Niezbędna jest wiedza specjalistyczna z zakresu neonatologii, klinicznej neurofizjologii, bioinżynierii oraz neuronauki rozwojowej.

Podczas przeprowadzania tych eksperymentów najwyższym priorytetem musi być opieka nad niemowlęciem. Pielęgniarka badawcza lub lekarz wykonujący nakłucie pięty ponosi odpowiedzialność za dobrostan niemowlęcia i musi zapewnić, że eksperyment jest przeprowadzany zgodnie z praktyką kliniczną. Do przeprowadzenia tych badań niezbędna jest zgoda szpitalnej komisji etycznej oraz pisemna zgoda rodziców.

Nakłucie pięty jest zabiegiem wymaganym klinicznie i nie może być powtarzane na potrzeby badania. Niezbędne jest zatem, aby rejestracja danych odbywała się w sposób niezawodny i stabilny, który nie zakłóca praktyki klinicznej ^{3, 4}. W szczególności kluczowe jest, aby metoda zastosowana do synchronizacji czasowej stymulacji była wiarygodna i nie utrudniała klinicznego pobrania krwi.

Wszystkie pomiary bólu u niemowląt są z konieczności pośrednie, dlatego kluczowe jest upewnienie się, że zarejestrowana aktywność jest wywołana konkretnie przez bodziec nocyceptywny, a nie przez inne aspekty opieki nad niemowlęciem ². Można to osiągnąć poprzez staranne zaprojektowanie techniczne badania oraz późniejsze przetwarzanie danych.