Stymulacja wzorzystych kultur neuronalnych za pomocą pola magnetycznego

Streszczenie

Źródło: Stern, S., et al., Zewnętrzne pobudzenie neuronów za pomocą pól elektrycznych i magnetycznych w kulturach jedno- i dwuwymiarowych. J. Vis. Exp. (2017)

Ten film demonstruje metodę stymulowania kultur neuronalnych hodowanych w wzorzystym okrągłym pierścieniu na szkiełku nakrywkowym, przy użyciu zmiennego w czasie pola magnetycznego.

Protokół

1. Przygotowanie szkiełek nakrywkowych do kultur 1D.

1. Szkiełka nakrywkowe należy oczyścić przez zanurzenie w roztworze podstawowym piranii składającym się z 75 ml DDW, 25 ml 25% roztworu amoniaku i 25 ml 30% nadtlenku wodoru. Roztwór ze szklanymi szkiełkami nakrywkowymi umieścić na płycie grzewczej w temperaturze ~ 50°C na 30 min, a następnie osuszyć szklane szkiełka nakrywkowe azotem.
2. Najpierw szkiełka nakrywkowe są pokrywane cienką warstwą chromu (99,999%) o grubości 6 A, a następnie warstwą złota o grubości 30 A (99,999%), przy użyciu osadzania z fazy gazowej lub napylania.
   1. Aby osiągnąć szybkość rozpylania 0,05 – 1 Μ / s, należy użyć napylarki z 2 wiązkami elektronowymi i systemem próżniowym 260 l/s o docelowych rozmiarach 2" i 4". Użyj etapu rotacji, który może przejść od 0 do 100 rund na minutę (RPM). Użyj prądu stałego (DC) o mocy rozpylania od 0 do 750 watów.
   2. Aby uzyskać plazmę o ciśnieniu 10 mTorr w komorze, należy obrócić urządzenie z prędkością 30 obr./min i użyć argonu o prędkości 99,999%.
   3. Zasilanie pistoletów do napylania należy uruchomić przy mocy napylania 40 W DC dla chromu, co prowadzi do szybkości pokrycia ~ 0,12 A/s, oraz przy mocy napylania 10 W DC dla złota, co prowadzi do ~ 0,28 A / s.
3. Za pomocą ultradźwięków przez 30 minut rozpuść 0,1 g 1-oktadekanotiolu w 100 ml ABS AR etanolu. Umieść szkiełka nakrywkowe pokryte Cr-Au w tym roztworze na 2 godziny, a następnie przemyj etanolem ABS AR i osusz azotem.
4. Przygotować roztwór 100 ml soli fizjologicznej buforowanej fosforanem Dulbecco (D-PBS) i 3,5 g trójblokowego kopolimeru (patrz Tabela materiałów/odczynników), mieszając przez 1 - 2 godziny przy 600 - 700 obr./min. Umieść szkiełka nakrywkowe w roztworze na 1 godzinę. Suche szkiełka nakrywkowe z azotem.
5. Mechanicznie wytrawić żądany wzór, zarysowując warstwę bioodrzutową. Zrób to za pomocą plotera pisakowego, w którym pióro jest zastąpione igłą do trawienia. Zdrap wzór przez warstwy metalu, aby dotrzeć do szkła znajdującego się pod spodem. Kontroluj ten proces przez komputer, aby uzyskać zreplikowany pożądany wzorzec. Wzorce powstałe w tym procesie pokazano na rysunkach 1 i 2.
6. Przygotuj biokompatybilną warstwę 100 ml D-PBS, 3,5 g kopolimeru tri-blokowego, 35,7 μl/ml fibronektyny i 29 μl/ml lamininy.
   1. Sterylizować szkiełka nakrywkowe w świetle ultrafioletowym przez co najmniej 10 minut. Szkiełka nakrywkowe inkubować w przygotowanym roztworze biokompatybilnym przez noc.
      UWAGA: Warstwa biokompatybilna utworzy się tylko tam, gdzie warstwa odrzucenia biologicznego została wytrawiona w poprzednim kroku.
   2. Następnego dnia umyj szkiełka nakrywkowe dwa razy za pomocą P-DBS. Inkubuj je w PM przez noc. Szkiełka nakrywkowe są teraz gotowe do powlekania komórkowego.

2. Utrzymanie kultur neuronalnych.

1. Przygotować pożywkę zmieniającą (CM) składającą się z (na ml): 0,9 ml MEM+3G, 0,1 ml HI HS, 10 μl 5-fluoro-2′-deoksyurydyny (FUDR) z urydyną 100x.
2. Przygotować pożywkę końcową (FM) składającą się z (na ml): 0,9 ml MEM+3G i 0,1 ml hi hs.
3. Zastąp PM 1-1,5 ml CM po 4 dniach in vitro (DIV). Przy 6 DIV zastąp 50% CM świeżym CM. W DIV 8 zmień pożywkę na 1,5 ml FM, a następnie 50% zmień FM co 2 dni. Po około tygodniu pojawia się spontaniczna aktywność synchroniczna.

3. Obrazowanie spontanicznej lub wywołanej aktywności w kulturach neuronalnych za pomocą barwników fluorescencyjnych.

1. Przygotować roztwór 50 μg wrażliwego na wapń barwnika fluorescencyjnego (patrz Tabela materiałów/odczynników) w 50 μl DMSO (dimetylosulfotlenku).
2. Przygotować zewnątrzkomórkowy roztwór zapisowy (EM) zawierający (w mM) 10 HEPES, 4 KCl, 2 CaCl₂, 1 MgCl₂, 139 NaCl, 10 D-glukozę, 45 sacharozę (pH 7,4).
3. Inkubować hodowlę neuronów w 2 ml EM z 8 μl wrażliwego na wapń roztworu barwnika fluorescencyjnego przez 1 godzinę. Chronić przed światłem i delikatnie obracać, aby zapewnić jednorodne rozprowadzenie barwnika do komórek.
4. Zastąp roztwór świeżym EM przed obrazowaniem. Obrazowanie fluorescencyjne przedstawiono na rysunku 3.
5. Obraz w mikroskopie fluorescencyjnym z filtrami optycznymi do obrazowania fluorescencji wapnia (pik wzbudzenia przy 488 nm, pik emisji przy 520 nm), przy użyciu kamery i oprogramowania zdolnych do ilościowego określenia intensywności dowolnego obszaru zainteresowania (ROI) w polu widzenia mikroskopu.

4. Magnetyczna stymulacja kultur

Uwaga: Podstawowa konfiguracja stymulacji magnetycznej jest pokazana na rysunku 1. W prawym górnym rogu pokazany jest odwrócony mikroskop fluorescencyjny, który służy do obrazowania wrażliwych na wapń barwników w neuronach. Cewka magnetyczna (niebieskie kółka) jest umieszczona około 5 mm koncentrycznie nad kulturą pierścienia neuronalnego (niebieski kontur). Cewka odbiorcza (czerwone kółko) na obwodzie szalki Petriego monitoruje napięcie indukowane przez impuls magnetyczny. W lewym górnym rogu pokazana jest zmierzona dynamika cewki stymulatora magnetycznego (MS) z obciążeniem napięciowym kondensatora 5 000 kV, zintegrowanej z cewką odbiorczą. Indukowane pole elektryczne (obliczone dla promienia pierścienia 14 mm) jest przedstawione na zielono, podczas gdy pole magnetyczne jest przedstawione na niebiesko. Na spodzie pokazane są zdjęcia kultury neuronalnej. W lewym dolnym rogu znajduje się zdjęcie w jasnym polu wzorzystego szkiełka nakrywkowego o średnicy 24 mm. Białe obszary to neurony. Sfotografowany wzór składa się z koncentrycznych kultur pierścieniowych o różnych promieniach. W prawym dolnym rogu znajduje się zbliżenie na krótki fragment pierścieni, pokazujący poszczególne neurony. W przypadku skali szerokość pierścieni wynosi około 200 μm.

1. Hoduj neurony w okrągłym wzorze pierścienia (wytrawionym zgodnie z opisem w 1.5) w celu stymulacji hodowli 1D. Do obrazowania wapnia należy użyć barwnika fluorescencyjnego wrażliwego na wapń (zgodnie z opisem w sekcji 3) z kulturą 1D wzorowaną na cienkich (170 μm), długich (10 mm) liniach.
   1. Użyj okrągłej cewki magnetycznej i umieść szalkę Petriego około 5 mm poniżej i koncentrycznie z cewką. Użyj niestandardowej cewki o średnicy około 30 mm (średnica wewnętrzna, średnica zewnętrzna 46 mm) o indukcyjności L = 90 mH napędzanej domowym lub komercyjnym MS obciążonym maksymalnym napięciem 5 kV.
   2. Aby magnetycznie stymulować kultury neuronalne, wysokie napięcie i prąd są odprowadzane przez cewkę przewodzącą za pomocą przełącznika wysokiego prądu i wysokiego napięcia. Stymulator magnetyczny (MS) może być zbudowany przy użyciu dużych kondensatorów, rzędu 100 mF, w celu uzyskania wysokiego napięcia 1 - 5 kV. Alternatywnie można użyć dostępnego w handlu MS (patrz Tabela materiałów/odczynników).
      nuta: Użyj prostokątnego drutu miedzianego o grubości 0,254 mm i szerokości 6,35 mm pokrytego poliestrem, aby wytworzyć domową cewkę. Przewody należy toczyć na niestandardowych ramach, izolowanych włóknem szklanym i odlewanych z żywicy epoksydowej (patrz Tabela materiałów/odczynników). Alternatywnie można użyć dostępnych w handlu cewek (patrz Tabela materiałów/odczynników).

Wyniki

Rysunek 1: Schemat układu używanego do stymulacji magnetycznej kultur neuronalnych. U góry pokazana jest cewka magnetyczna (niebieskie kółka), która znajduje się 5 mm koncentrycznie nad kulturą pierścienia neuronalnego, umieszczoną na szalce Petriego (niebieski kontur). Cewka odbiorcza (czerwone kółko) umieszczona na obwodzie szalki Petriego mierzy napięcie indukowane przez impuls magnetyczny. Na do...

Materiały

Lista materiałów użytych w tym artykule

Nazwa	Firma	Numer katalogowy	Komentarze
CaCl2 , 1M	Przywra	Numer katalogowy: 21098	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego
D-(+)-glukoza, 1M	Sigma-Aldrich	Numer katalogowy: 65146	Pożywka galwaniczna, roztwór do zapisu zewnątrzkomórkowego
D-PBS (Sieć Demokratyczna)	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał D8537	Hodowle komórkowe
Fibronektyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał F1141	Powłoka biologiczna
Fluo4, AM	Technologie życiowe	F14201	Obrazowanie aktywności spontanicznej lub wywołanej
FUDR	Sigma-Aldrich	F0503	Zmiana medium
Gentamycyna	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał G1272	Podłoże galwaniczne, Medium zmieniające, Medium końcowe.
Hepes, 1M	Sigma-Aldrich	H0887	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego
CZEŚĆ HS	bi	04-124-1A	Medium galwaniczne, Medium zmieniające, Medium końcowe
KCl, 3M	Merck	1049361000	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego
Laminina	Sigma-Aldrich	L2020	Powłoka biologiczna.
MEM x 1	Gibco (firma Gibco)	Numer katalogowy 21090-022	Medium galwaniczne, Medium zmieniające, Medium końcowe
Chlorek magnezu, 1M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał M1028	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego
NaCl, 4M	Laboratorium biologiczne	19030591	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego
Oktadekanotiol	Sigma-Aldrich	Rok 1858	Czyszczenie szkiełek nakrywkowych z powłoką Cr-Au (kultury 1D)
Sacharoza, 1M	Sigma-Aldrich	Zobacz materiał S1888	Rozwiązanie do nagrywania zewnątrzkomórkowego
Urydynę	Sigma-Aldrich	U3750	Zmiana medium
Maszyna do rozpylania	AJA International, Inc	ATC Orion-5Series	Powlekanie szkła cienkimi warstwami metalu
Ploter pisakowy	Hewlett Packard	HP 7475A	Wytrawianie wzoru na powlekanym szkiełku nakrywkowym
zasilacz	matryca	Zobacz materiał MPS-3005 LK-3	Zasilanie maszyny do napylania
Epoksydowa	Cognis powiedział:	Wersamid 140	Odlewanie kręgów domowej roboty
Epoksydowa	skorupa	EPON 815 (wersja	Odlewanie kręgów domowej roboty

powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: powiedział: angielska)