Wykorzystanie matryc wieloelektrodowych do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D

W tym artykule

Streszczenie

Źródło: Cvetkovic, C., et al. Modelowanie mikroukładów synaptycznych z kokulturami 3D astrocytów i neuronów z ludzkich pluripotencjalnych komórek macierzystych. J. Vis. Exp. (2018)

Ten film demonstruje procedurę użycia matrycy wieloelektrodowej (MEA) do pomiaru fizjologii synaptycznej w sferach kokultury 3D. Metoda ta pozwala zrozumieć dynamikę sieci neuronowych i aktywność impulsów sieci synaptycznych w sferach 3D.

Protokół

Pomiar żywej fizjologii synaptycznej za pomocą matryc wieloelektrodowych (MEA)

1. Przygotuj MEA do hodowli komórkowej.

Oczyść powierzchnię każdego MEA 1 ml detergentu przez 1 godzinę. Spłucz sterylną wodą dejonizowaną (DI), spłucz 70% etanolem w celu sterylizacji, a następnie wysusz na powietrzu w komorze bezpieczeństwa biologicznego w świetle UV.
nuta: MEA mogą być przechowywane w wodzie demineralizowanej w temperaturze 4 °C w sterylnych warunkach do czasu użycia.
Przygotować roztwór poliornityny (PLO) o stężeniu 0,5 mg/ml, rozpuszczając 50 mg PLO w 100 ml buforu kwasu borowego. Pokryć powierzchnię każdego MEA 1 ml PLO w celu nadania mu hydrofilowości i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny. Usuń PLO i umyj powierzchnię wodą DI.
Rozcieńczyć roztwór powlekający macierz zewnątrzkomórkową (ECM) podłożem podstawowym (DMEM/F12) w celu przygotowania roztworu podstawowego o stężeniu 1 mg/ml. Aby uzyskać roztwór roboczy, należy ponownie zawiesić 3 ml materiału wyjściowego ECM w 33 ml wstępnie schłodzonego podłoża DMEM/F12, zwiększając całkowitą objętość do 36 ml dla stężenia 80 μg/ml.
Dodać 1 ml roztworu roboczego ECM do każdego MEA i inkubować w temperaturze 37 °C przez co najmniej 4 godziny.
Wyjmij ECM i umieść kulki w 1.5 ml pożywki na powierzchni MEA, upewniając się, że kulki są umieszczone na górze układu elektrod (rysunki 1A, 1A'). Pozostaw nośnik do przylegania przez 2 dni. Zmieniaj połowę podłoża co 2-3 dni (lub częściej, jeśli to konieczne), upewniając się, że sfery nie są zakłócone.
nuta: Dodanie czynników wzrostu może poprawić przeżywalność i dojrzewanie kultur.

2. Zmierz aktywność elektryczną sfer neuronowych.

Skonfiguruj system z matrycą wieloelektrodową (MEA) ze sceną czołową o kontrolowanej temperaturze. Utwórz program z filtrem górnoprzepustowym 5 Hz, filtrem dolnoprzepustowym 200 Hz i progiem skoku 5-krotnego odchylenia standardowego (SD).
Umieść MEA na scenie głównej i zarejestruj spontaniczną aktywność elektryczną (Rysunek 1B, B'). Zapisuj nieprzetworzone dane, w tym częstotliwość i amplitudę skoków, do analizy statystycznej.
nuta: System perfuzyjny może być wykorzystany z MEA do dodania środków farmakologicznych lub zwiększenia przepływu świeżych nośników do długotrwałego nagrywania. W razie potrzeby można wykonać dodatkowe przetwarzanie końcowe spajków.

Dostęp ograniczony. Zaloguj się lub rozpocznij wersję próbną, aby wyświetlić tę treść.

Wyniki

figure-results-1
Rysunek 1: Reprezentatywna fizjologia synaptyczna na żywo sfer nerwowych na matrycach wieloelektrodowych (MEA). (A, A') MEA są wykorzystywane do pomiaru żywej fizjologii synaptycznej sfer nerwowych. Kule iNeurons (A) lub kokultury iNeurons i hAstros (A') mogą być hodowane na powierzchniach MEA za pomocą substratów naśladujących ECM (patrz krok 4.1). (B, B') Wykresy ...