$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
1. Ablacja subpopulacji neuronów za pomocą dwufotonowego mikroskopu laserowego
UWAGA: Jeśli użytkownicy planują wykonać obrazowanie Ca po ablacji, skorzystaj z linii UAShspzGCaMP6s. Jeśli użytkownicy planują wykonanie rejestracji behawioralnej po ablacji, należy użyć linii UAS:EGFP, ponieważ ablacja komórek EGFP-dodatnich jest łatwiejsza do wykonania niż komórek wykazujących ekspresję GCaMP6s.
- Zacznij od skonfigurowania krycia linii Gal4, która oznacza określone neurony do badania i UAS:EGFP lub UAShspzGCaMP6s. Pamiętaj, aby użyć tła masy perłowej dla obojga rodziców, aby można było uzyskać homozygoty masy perłowej.
nuta: Homozygoty masy perłowej nie zawierają melanoforów na powierzchni ciała (ryc. 1B). W niniejszym badaniu zastosowano linię Gal4 gSAIzGFFM119B (która oznacza prefektu) i inną linię Gal4 hspGFFDMC76A (która oznacza ILH).
- Następnego dnia po utrwaleniu godów zbierz jaja danio pręgowanego i podnieś je do stadium larwalnego, w którym to momencie neurony będące przedmiotem zainteresowania będą wyrażać fluorescencyjne reportery.
- Zamontuj larwy danio pręgowanego w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia (ryc. 1B).
- Zacznij od przygotowania 2% roztworu podstawowego agarozy: Rozpuść 2 g proszku agarozy o niskiej temperaturze topnienia w 100 ml wody systemowej (tj. wodzie używanej do utrzymywania dorosłego danio pręgowanego w systemie wody krążącej) lub wodzie E3, podgrzewając wodę do temperatury wrzenia w kuchence mikrofalowej i energicznie mieszając.
- Podgrzewaj w kuchence mikrofalowej 2% bulion agarozy o niskiej temperaturze topnienia, aż się zagotuje. Wlej 3,5-4,0 ml agarozy na pokrywkę 6-centymetrowej szalki Petriego. Poczekaj, aż agaroza ostygnie, aby była ciepła w dotyku, zanim przejdziesz dalej.
- Następnie umieść pojedynczą larwę (nie znieczuloną na tym etapie) w agarozie. Kontynuuj regulację pozycji i orientacji larwy tak, aby była pionowa, używając igły do preparowania (ryc. 1C), aż agaroza zestali się, aby zapewnić prawidłowe ułożenie larwy.
nuta: Larwa będzie nadal pływać, podczas gdy agaroza zestala się.
- Po umieszczeniu larwy odczekaj 5 minut, aż agaroza całkowicie się zestali.
- Wlać 5 ml roztworu tricainy (0,4% przy 1x stężeniu roboczym) na agarozę.
nuta: Aby uniknąć ruchów larw podczas ablacji laserowej, larwy muszą być znieczulone przez cały czas trwania procedury ablacji.
- Abblować larwę za pomocą funkcji wybielania w dwufotonowym systemie mikroskopii laserowej.
- Umieść larwę zanurzoną w agarozie pod dwufotonowym laserowym mikroskopem skaningowym i uruchom system mikroskopowy.
- Uruchom oprogramowanie do akwizycji obrazu i kliknij przycisk "Włącz" na karcie "Laser", aby włączyć laser (Rysunek 1D). Poczekaj, aż "Stan" lasera zmieni się z "Zajęty" na "Zablokowany w trybie".
- W zakładce "Kanały" ustaw długość fali lasera na 880 nm (maksymalna moc: około 2 300 mW) dla ablacji EGFP lub na 800 nm (maksymalna moc: około 2 600 mW) dla ablacji GCaMP.
- Wybierz soczewkę obiektywu 20X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu. Kliknij kartę "Zlokalizuj", kliknij "GFP", aby zmienić ścieżki optyczne i bezpośrednio view fluorescencja na oko.
- Zlokalizuj mózg larwy danio pręgowanego w centrum view, a następnie kliknij zakładkę "Akwizycja", aby wrócić do mikroskopii dwufotonowej.
- Aby zapisać stan "przed ablacją", należy wykonać zdjęcie stosu z użyciem soczewki obiektywu 20X z dużą szybkością skanowania (aby uniknąć uszkodzeń spowodowanych wysoką temperaturą). Później porównaj obrazy wykonane przed i po eksperymentach ablacyjnych (ryc. 2A). Aby uzyskać z-stack, kliknij "Z-Stack", aby wybrać opcję z-stack i rozwinąć zakładkę. Ustaw dolną granicę (kliknij przycisk "Ustaw najpierw") po skupieniu się na brzusznym końcu mózgu larwy i ustaw górną granicę (kliknij przycisk "Ustaw ostatnią") po skupieniu się na najbardziej grzbietowej powierzchni mózgu. Następnie kliknij przycisk "Rozpocznij eksperyment", aby uruchomić akwizycję obrazu z-stack.
- Wybierz soczewkę obiektywu 63X, ręcznie przesuwając rewolwer obiektywu.
- Kliknij kartę "Zlokalizuj", aby przełączyć się na mikroskopię epifluorescencyjną, zlokalizuj komórki do ablacji w centrum view przez oko, a następnie kliknij kartę "Akwizycja", aby wrócić do laserowej mikroskopii skaningowej.
- Na karcie "Tryb akwizycji" ustaw "Rozmiar ramki" na 256 x 256. Kliknij "Na żywo" i obserwuj interesujące Cię neurony.
- Zaczynając od najbardziej grzbietowej strony, znajdź płaszczyznę ogniskową, w której komórki do ablacji są ostre.
- Zaznacz mały, okrągły obszar o średnicy około jednej trzeciej średnicy komórki na każdym neuronie jako obszar zainteresowania (ROI) za pomocą funkcji "Regiony".
- Ustaw prędkość skanowania na 13,93 s/256 x 256 pikseli (134,42 μm x 134,42 μm), co odpowiada czasowi przebywania lasera wynoszącemu około 200 μs/piksel lub 200 μs/0,5 μm. Ustaw również 4 powtórzenia ("Cykl iteracji: 4"). Alternatywnie zoptymalizuj liczbę iteracji i szybkość skanowania, aby osiągnąć wystarczającą ablację.
- Wykonaj funkcję "Wybielanie" dla ablacji, w połączeniu z "Szeregiem czasowym (2 cykle)" w celu zobrazowania próbki (przed i po ablacji) oraz "Regiony" (w celu ustawienia zwrotu z inwestycji) lub równoważnymi funkcjami w używanym oprogramowaniu (rysunek 1D).
- Porównując pierwszy obraz (przed ablacją) i drugi obraz (po ablacji) w cyklu szeregów czasowych, upewnij się, że po wybielaniu fluorescencja w docelowych komórkach zmniejsza się do wartości obserwowanej na poziomie tła (ryc. 2B).
- Jeśli fluorescencja jest nadal obecna po ablacji, zwiększ liczbę iteracji.
- Następnie przesuń płaszczyznę ogniskową nieco głębiej (tj. w kierunku strony brzusznej) i wybierz kolejną płaszczyznę ogniskowej, w której pojawiają się komórki niepoddane ablacji.
- Wykonaj funkcję wybielania zgodnie z powyższym opisem (krok 1.9). Powtarzaj te kroki, aż wszystkie komórki w interesującej nas strukturze neuronalnej zostaną usunięte.
- Po przejściu przez wszystkie płaszczyzny ogniskowe pokrywające struktury nerwowe, które mają zostać poddane ablacji, sprawdź komórki pod kątem zniesionej fluorescencji. Jeśli okaże się, że niektóre komórki nadal są fluorescencyjne z powodu niewystarczającej ablacji, należy je ponownie naświetlić laserowo, jak opisano powyżej.
- Jeśli larwa musi zostać odzyskana z agarozy po napromieniowaniu laserowym, nie próbuj wypychać jej z agarozy, ponieważ może to uszkodzić larwę. Zamiast tego ostrożnie wykonaj drobne nacięcia w agarozie wokół larwy prostopadle do powierzchni jej ciała. Następnie poczekaj, aż larwa sama wypłynie z agarozy, gdy środek znieczulający ustąpi.
- Przejdź do następnej larwy w celu ablacji lub przeprowadź eksperymenty kontrolne przy użyciu innej populacji neuronów, które nie są zaangażowane w badane zachowanie.
nuta: Tutaj, jako kontrola, neurony opuszki węchowej w UAS:EGFP; Larwy gSAIzGFFM119B zostały poddane ablacji laserowej przy użyciu tego samego protokołu opisanego powyżej (ryc. 2A, po prawej).
- Odczekaj kilka godzin lub 1 dzień na regenerację przed przystąpieniem do obrazowania Ca (sekcja 2) lub rejestracji behawioralnej (sekcja 3). W tym czasie rekonwalescencji należy sprawdzić stan zdrowia larw (tj. normalne spontaniczne pływanie, brak widocznych uszkodzeń termicznych wokół obszaru poddanego ablacji itp.) i usunąć larwy wykazujące jakiekolwiek oznaki złego stanu zdrowia.
2. Obrazowanie wapnia w celu zarejestrowania aktywności neuronalnej wywołanej przez ofiarę u larw danio pręgowanego
- Aby przygotować komorę zapisu, umieść uszczelkę komory hybrydyzacyjnej z bezpiecznym uszczelnieniem na szkiełku podstawowym do szyby, stroną klejącą skierowaną do szkła i zdejmij górną uszczelkę.
nuta: W ten sposób powstaje mała komora zapisu o średnicy 9 mm i głębokości 0,8 mm (rysunek 3A).
- Następnie umieść nylonową siatkę (rozmiar otworu: 32 μm) na probówce o pojemności 50 ml, która ma rozcięte dno. Użyj nasadki, aby przymocować siatkę do rurki (Rysunek 3B).
- Przygotuj pantofelka (który jest zdobyczą, która ma być wykorzystana jako bodziec wzrokowy dla larwy).
nuta: Przygotuj wcześniej kulturę pantofelka (kroki 2.3.1 i 2.3.2).
- Zdobądź wcześniej kulturę nasion pantofelka ze źródeł komercyjnych lub akademickich centrów zasobów biologicznych.
- Hodować pantofelek przez kilka dni w wodzie zawierającej autoklawizowaną słomę ryżową i granulkę suchych drożdży piwnych (ryc. 3C).
- Przelej kulturę pantofelka kolejno przez 2 sita (jedno z aperturą 150 μm, a następnie drugie z aperturą 75 μm), aby usunąć zanieczyszczenia z kultury.
- Zbierz pantofelek w przepływie z poprzedniego kroku na siatce nylonowej (otwór 13 μm).
- Ponownie zawieś pantofelek na nylonowej siatce w szklanej zlewce za pomocą wyciśniętej butelki z wodą systemową (Rysunek 3D).
- Opłucz siatkę (Rysunek 3B) w wodzie systemowej 2x (Rysunek 3E).
nuta: Celem tego etapu jest usunięcie wszelkich możliwych substancji zapachowych i smakowych zawartych w pożywce hodowlanej pantofelków, ponieważ celem niniejszego badania jest obserwacja wizualnie sterowanej aktywności neuronalnej.
- Umieść larwę danio pręgowanego w roztworze tricainy w celu znieczulenia.
- Zamontuj pojedynczą larwę w 2% agarozie o niskiej temperaturze topnienia.
- Najpierw podgrzej w kuchence mikrofalowej 2% agarozę o niskiej temperaturze topnienia i dodaj 1/10 objętości 10x stężonej trikainy do agarozy.
- Umieścić jedną kroplę agarozy zawierającej trikainę w komorze rejestrującej (ryc. 3A).
- Po upewnieniu się, że agaroza nie jest zbyt gorąca, umieść znieczuloną larwę (z kroku 2.5) w agarozie, natychmiast usuwając nadmiar agarozy, tak aby powierzchnia agarozy wyglądała na lekko wypukłą.
- Szybko ustaw larwę w pozycji pionowej za pomocą igły preparującej (ryc. 1C).
nuta: Procedury te muszą zostać zakończone w ciągu kilku sekund, zanim agaroza zastygnie.
- Gdy larwa zostanie prawidłowo umieszczona, odczekaj 5 minut, aż agaroza całkowicie się zestali. Następnie wlej kroplę 1x roztworu tricainy na agarozę.
- Usuń agarozę wokół głowy larwy danio pręgowanego i zrób miejsce na pantofelek do pływania za pomocą noża chirurgicznego. Aby to zrobić, najpierw wykonaj kilka małych nacięć w agarozie (ryc. 3F). Następnie ostrożnie usuń nadmiar agarozy, delikatnie wylewając wodę systemową na komorę.
nuta: Na tym etapie tricaine zostanie wypłukana.
- Następnie umieść jeden pantofelek w komorze nagrywającej, aby służył jako bodziec wizualny.
nuta: Kiedy pantofelek pływa w pobliżu głowy larwy danio pręgowanego, wywoła reakcję neuronalną (ryc. 3G).
- Umieść komorę zapisu pod mikroskopem epifluorescencyjnym wyposażonym w naukową kamerę CMOS (rysunek 3H) i wybierz obiektyw 2,5x (rysunek 3I).
- Zbieraj nagrania poklatkowe sygnałów fluorescencyjnych GCaMP.
- Uruchom aplikację do akwizycji obrazu dla wyposażonej kamery.
- Kliknij "Okienko sekwencji" i wybierz "Rekord dysku twardego" w okienku. W sekcji Scan Settings (Ustawienia skanowania) ustaw "Frame Count" (Liczba klatek) na 900 lub dowolny inny żądany łączny numer klatki.
nuta: Jeśli to możliwe, użyj oprogramowania do nagrywania poklatkowego z modułem (tutaj "Hard Disk Record"), który umożliwia efektywne zapisywanie danych na dysku twardym.
- W okienku "Przechwytywanie" ustaw czas ekspozycji na 30 ms (tj. 33,3 kl./s) i Binning 2 x 2.
- Na panelu dotykowym sterowania mikroskopem wybierz zestaw filtrów dla GFP, ponieważ GCaMP ma podobne widma wzbudzenia/emisji do GFP.
- Kliknij "Na żywo" w okienku przechwytywania, aby zlokalizować larwę w widoku kamery i ustawić ostrość (Rysunek 4A), a następnie kliknij "Zatrzymaj na żywo" i kliknij przycisk "Start". Zapisz film w formacie .cxd lub innym formacie zawierającym informacje o warunku pozyskania.
