$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
Wszystkie procedury dotyczące próbek zwierzęcych zostały sprawdzone i zatwierdzone przez odpowiednią komisję ds. oceny etycznej zwierząt.
1. Elektrofizjologia
UWAGA: Celem tego protokołu jest uzyskanie zapisów cęgów prądowych całych komórek z neuronów komórek piramidalnych warstwy II/III, zidentyfikowanych wizualnie przez ekspresję GFP w mózgach myszy poddanych elektroporacji GFP (lub jakiegokolwiek innego białka fluorescencyjnego wcześniej elektroporowanego). Korzystając z tego protokołu, możliwe jest zbadanie wpływu modyfikacji genetycznej wprowadzonej przez IUE na właściwości elektryczne neuronu. Akwizycja określonych trybów wypalania jest stopniowym procesem różnicowania, który obejmuje dynamiczną ekspresję szerokiego repertuaru kanałów jonowych i który skutkuje ekspresją przejściowych trybów wypalania przed późnymi stadiami postnatalnymi. Na przykład dojrzałe reakcje elektryczne nie są obserwowane w warstwach II/III somatosensorycznej kory myszy przed P16.
- Wymagania wstępne dotyczące wycinków ostrych
- Przygotuj 1 l ACSF przy użyciu wody o wysokiej czystości (podwójnie destylowana) zawierającej 119 mM NaCl, 26 mM NaHCO3, 11 mM glukozy, 2,5 mM KCl, 1,2 mM MgCl2, 2,5 mM CaCl2 i 1 mM NaH2PO4. Miareczkować pH do 7,3 - 7,4 za pomocą HCl lub NaOH. Dostosuj osmolarność do 290 mOsm.
- Pęcherzyk ACSF z karbogenem (95% O2/5% CO2 ) przez 15 - 20 min za pomocą rurek teflonowych (~ 1 mm), w celu ustabilizowania pH do 7,3 - 7,4.
- Wymagania wstępne dotyczące nagrywania całej komórki
- Upewnij się, że stacja elektrofizjologii jest wyposażona w komorę rejestracyjną, system perfuzyjny, mikroskop, elektrody (rejestrującą, stymulującą i uziemiającą), makro- i mikromanipulatory, sztywny, odporny na wibracje blat stołu i klatkę Faradaya, stymulator, wzmacniacz i przetwornik analogowo-cyfrowy (A/D), komputer z oprogramowaniem akwizycyjnym oraz filtr GFP (lub dowolny inny fluorochrom) do analizy genetycznie zmodyfikowanych neuronów (ryc. 1A).
- Przygotować roztwór wewnątrzkomórkowy zawierający 115 mM glukonianu potasu, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES, 20 mM KCl, 4 mM Na2ATP i 0,3 mM Na3GTP, dostosowany do pH 7,2 przez KOH i do 290 mOsm przez KCl.
- Wykonaj pipety z łatkami, ciągnąc kapilary ze szkła borokrzemianowego. Przygotować elektrody do plastrów za pomocą ściągacza do mikropipet. Używaj kapilar borokrzemianowych (średnica zewnętrzna 1,5 mm, średnica wewnętrzna 0,86 mm, długość 10 cm). Wykonaj elektrody łatowe wykazujące rezystancję 3-10 MΩ po napełnieniu roztworem wewnątrzkomórkowym.
- Przeprowadzić napełnienie komory rejestracyjnej ACSF z szybkością 2 ml/min. Utrzymać temperaturę komory na poziomie około 33 °C.
- Nagrywanie całej komórki
- Przenieś plastry do komory zapisu za pomocą pipety Pasteura (odetnij długą końcówkę) lub małego pędzelka. Przytrzymaj plasterek za pomocą harfy. Perfuzuj plastry w sposób ciągły za pomocą ACSF z szybkością 2 ml/min.
- Załataj neuron GFP-dodatni.
- Umieść plasterek w komorze nagrywającej i znajdź obszar zainteresowania przez mikroskop przy małym powiększeniu (10X). Następnie znajdź komórkę GFP-dodatnią do załatania za pomocą obiektywu 60x.
- Napełnij elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym. Użyj strzykawki połączonej z filtrem (filtr 4 mm) i końcówką mikroładowarki, aby napełnić elektrodę rejestrującą roztworem wewnątrzkomórkowym.
- Umieść szklaną pipetę w uchwycie na pipety. Umieść końcówkę pipety w kąpieli i skup się na końcówce. Gdy pipeta znajdzie się w kąpieli, należy zastosować nadciśnienie przez system kontroli ciśnienia wstecznego.
- Łatać neuron, który jest fluorescencyjny (ryc. 1B).
- Zbliżyć się do celi zainteresowania pod kierunkiem wizualnym, utrzymując ciśnienie wsteczne w pipecie. Po pojawieniu się małego wgłębienia na powierzchni komórki zwolnij ciśnienie. W tym momencie może powstać szczelne uszczelnienie (rezystancja większa niż 1 GΩ). W przeciwnym razie zastosuj lekkie podciśnienie (ssanie), aby to ułatwić.
- Podczas formowania uszczelki doprowadzić napięcie trzymania clamp do -60 mV. Po uformowaniu uszczelki GΩ zastosuj impuls ssania, aby rozerwać błonę komórkową pod pipetą i przejść w tryb całej komórki.
- Rejestruj aktywność przy użyciu warunków cęgów prądowych. W trybie całych ogniw przełącz się z trybu cęgów napięciowych na cęgi prądowe i rozpocznij nagrywanie. Na przykład, aby zarejestrować pobudliwość komórek, zastosuj wstrzyknięcia prądu depolaryzującego o długości 500 ms (100 - 400 pA).
- Oblicz szybkość wypalania, wykreślając liczbę potencjałów czynnościowych wzdłuż pociągu dla rosnących prądów wejściowych.
nuta: Na podstawie zapisów można również obliczyć spoczynkowy potencjał membrany, rezystancję wejściową i pojemność membrany.
