Wszystkie procedury dotyczące modeli zwierzęcych zostały sprawdzone przez lokalny instytucjonalny komitet opieki nad zwierzętami oraz weterynaryjną komisję rewizyjną JoVE.
1. Obchodzenie się z prosiętami i prosiętami
- Korzystaj z samców i samic prosiąt w sposób systematyczny i losowy, aby wyeliminować wszelkie potencjalne czynniki zakłócające związane z płcią, zgodnie z wytycznymi ARRIVE.
UWAGA: Ponieważ okres maksymalnego wzrostu mózgu przypada na 3-5 dni od urodzenia prosiąt, eksperymenty przeprowadza się wyłącznie na prosiętach w wieku 3-5 dni.
- Upewnij się, że prosięta przybędą do wiwarium co najmniej 24 godziny przed eksperymentami, aby umożliwić aklimatyzację w środowisku.
nuta: Przeszkolony personel weterynaryjny zapewnia rutynową opiekę nad zwierzętami. Prosięta są trzymane w indywidualnie utrzymywanych, stale monitorowanych klatkach i otrzymują pełnowartościowy preparat mlekozastępczy ad libitum, aby zapobiec hipoglikemii. Prosięta są również trzymane bez preparatu mlekozastępczego (zero na os) przez co najmniej 3 godziny przed znieczuleniem i są zaopatrywane w koce i zabawki, aby zapewnić normalny poziom stymulacji. Jeśli to możliwe, trzymaj wiele prosiąt w tej samej klatce, aby umożliwić socjalizację.
2. Rozwój i dostosowanie matryc mikroelektrod (MEA) do badań neurotoksyczności indukowanej znieczuleniem (AIN) w modelu prosiąt
UWAGA: Ta technologia wykorzystuje MEA oparte na enzymach, które są wstępnie pokryte enzymem i galwanizowane dichlorowodorkiem m-fenylenodiaminy (mPD). Elektrody zostały specjalnie zaprojektowane ze sztywnym wałem o średnicy 40 mm i wyprodukowane do stosowania u prosiąt (ilustracja 1).
- Proszę zapoznać się ze szczegółowym opisem przygotowania i kalibracji MEA (Rysunek 2).
3. Znieczulenie i użycie niestandardowego aparatu stereotaktycznego dla prosiąt
- Znieczulanie zwierząt za pomocą stanowiska anestezjologicznego z odpowiednim respiratorem i urządzeniami monitorującymi oraz monitorowanie parametrów fizjologicznych, takich jak pulsoksymetria, nieinwazyjne ciśnienie krwi, elektrokardiografia i temperatura przez cały czas trwania eksperymentu, jak opisano wcześniej. Zaintubować i przewietrzyć prosięta, a następnie podawać znieczulenie sewofluranem przy 1 minimalnym stężeniu pęcherzykowym (MAC) (około 2,5-3%) przez 3,5 godziny. Upewnij się, że przeszkoleni pracownicy laboratorium są obecni podczas tych eksperymentów. Sierść pokrywająca obszar operowany jest usuwana za pomocą elektrycznych maszynek do strzyżenia przed przygotowaniem skóry.
nuta: Stężenie i czas trwania zastosowanego środka znieczulającego pozwala eksperymentowi symulować czas rzeczywistej ekspozycji na znieczulenie podczas zabiegu chirurgicznego. Ponadto sewofluran jest najczęściej stosowanym środkiem znieczulenia ogólnego w populacji pediatrycznej, co sprawia, że badania dotyczące jego bezpieczeństwa mają ogromne znaczenie.
- Przed umieszczeniem w ramie stereotaktycznej należy rozpocząć podawanie rokuronium w dawce nasycającej 2,5 mg/kg mc. i infuzji 1,5 mg/kg/h, aby zapobiec przemieszczaniu się zwierzęcia w ramie.
- Umieść prosię w ramce stereotaktycznej specyficznej dla prosiąt, gdy odpowiednia głębokość znieczulenia zostanie potwierdzona przez uszczypnięcie palca.
- Zapewnij odpowiednią wyściółkę w ramie stereotaktycznej, umieszczając prosię na podkładce rozgrzewającej z wymuszonym powietrzem z dodatkową wyściółką (np. pozycjonerem fluidalnym), aby zapobiec odleżynom.
- Umieść zęby górnej żuchwy nad listwą zębatą (ryc. 3).
nuta: Listwa zębowa powinna znajdować się na wystarczającym poziomie, aby utrzymać czaszkę bardzo mocno na miejscu.
- Zamocuj i dokręć penetrujące nauszniki w uszach, uważając, aby prosię znajdowało się w pozycji środkowej. Umieść spiczaste końcówki bocznych uchwytów w przewodzie słuchowym i włóż listwy uszne na tyle mocno, aby usłyszeć dźwięk "trzasku" związany z penetracją błony bębenkowej. Mocno przymocuj nauszniki do czaszki i włóż je na równą głębokość z każdej strony, aby zapobiec ruchowi czaszki podczas eksperymentu (Rysunek 4, Panel A).
nuta: Niezwykle ważne jest, aby utrzymywać prosięt w cieple (~ 37,8-38,6 °C) i stale monitorować temperaturę podczas całej procedury w celu utrzymania normotermii. Można to osiągnąć za pomocą koca i/lub lampy grzewczej. Pamiętaj, aby umieścić lampę grzewczą w odpowiedniej odległości, aby uniknąć poparzenia skóry zwierzęcia.
- Wykonaj nacięcie w linii środkowej o długości 4-6 cm wzdłuż czaszki, zachowując ostrożność, aby uniknąć natarcia czaszki skalpelem. Po wykonaniu nacięcia użyj delikatnego wycofania i rozwarstwienia, aby podnieść skórę głowy od czaszki. Delikatnie wyszoruj czaszkę gazikiem, aby usunąć tkankę łączną i odsłonić linie szwów (Ryc. 4, Panel B).
nuta: Nie jest konieczne zachowanie sterylności podczas eksperymentów niemających na celu przeżycia. Jednak podczas eksperymentów survivalowych należy zachować sterylność.
- W razie potrzeby należy dodatkowo odbić skórę głowy, aby odsłonić obszar zainteresowania i określić zamierzoną lokalizację kraniotomii (ryc. 5, panel A). Użyj wiertła chirurgicznego, aby stworzyć okno kraniotomii o długości około 0,25cm2 (może być większe lub mniejsze w zależności od celów eksperymentalnych) nakładające się na strukturę będącą przedmiotem zainteresowania, zachowując ostrożność, aby nie uszkodzić opony twardej lub leżącego poniżej mózgu (ryc. 5, panel B). Użyj cienkich nożyczek chirurgicznych, aby wyciąć oponę twardą pokrywającą tkankę mózgową (ryc. 5, panel C).
- Umieść elektrodę tak pionowo, jak to możliwe nad bregmą, mocując metalowe ramię stopnia czołowego do mikromanipulatora stereotaksu prosiąt. Opuść elektrodę tak bardzo, jak to możliwe, nie dotykając powierzchni czaszki. Zapisz współrzędne bregmy (Rysunek 6, Panel A).
- Określ współrzędne przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne, a także głębokość interesującej nas struktury w odniesieniu do bregmy. Określ współrzędne stereotaktyczne za pomocą atlasu stereotaktycznego odpowiedniego dla gatunku i wieku. W takim przypadku należy skorzystać z atlasu stereotaktycznego opracowanego specjalnie dla prosiąt.
- Zmień położenie elektrody tak, aby miała prawidłowe położenie przednio-tylne i przyśrodkowo-boczne, upewniając się, że zarówno mikroelektroda, jak i aparat są prostopadłe do powierzchni. Umieść pseudoelektrodę referencyjną pod skórą głowy, zapewniając kontakt ze zwierzęciem (Rysunek 6, Panel B).
- Powoli i delikatnie opuść elektrodę na odpowiednią głębokość w głąb mózgu za pomocą ramienia stereotaktycznego. W przypadku końcowych 2 mm użyj mikronapędu hydraulicznego, aby dalej napędzać elektrodę do dokładnego miejsca (Rysunek 6, Panel C).
nuta: Położenie elektrody powinno leżeć nad okienkiem kraniotomii. Głębokość elektrody będzie się różnić w zależności od interesującej struktury mózgu. Nie jest konieczne zamykanie nacięcia po zakończeniu zbierania danych w eksperymentach niemających na celu przeżycia.
4. Pomiar glutaminianu zewnątrzkomórkowego w znieczuleniu Sewofluranem
- Upewnij się, że prosię jest pod ciągłym nadzorem fizjologicznym przez cały czas trwania tej procedury. Prosięta są znieczulane wziewnie (przez stożek twarzowy) w ramach przygotowań do zabiegu.
- Po implantacji MEA należy odczekać 30 minut, aby elektroda osiągnęła linię bazową, aby zapewnić prawidłowy pomiar przez 3 godziny (ryc. 7).
- 0,25% bupiwakainy (1 ml/kg) podaje się podskórnie w miejsce zabiegu w celu leczenia bólu pooperacyjnego. Ponadto buprenorfina o przedłużonym uwalnianiu jest podawana podskórnie co 72 godziny, w zależności od potrzeb.
